Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo
Summary
Este protocolo proporciona un método rápido y fiable para medir cuantitativamente la fagocitosis de Aspergillus fumigatus conidia por los fagocitos primarios humanos utilizando citometría de flujo y para discriminar la fagocitosis de la conidia de la mera adhesión a los leucocitos.
Abstract
La infección pulmonar invasiva por el moho Aspergillus fumigatus representa una gran amenaza para los pacientes inmunocomprometidos. La conidia fúngica inhalada (esporas) se elimina de los alvéolos pulmonares humanos al ser fagocitos innatados por monocitos innatos y/o neutrófilos. Este protocolo ofrece una medición rápida y fiable de la fagocitosis mediante citometría de flujo utilizando conidia etiquetada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) para la coincubación con leucocitos humanos y posterior contramancha con un anticuerpo anti-FITC para permitir la discriminación de la conidia internaizada y celular. Las principales ventajas de este protocolo son su rapidez, la posibilidad de combinar el ensayo con el análisis citométrico de otros marcadores celulares de interés, el análisis simultáneo de monocitos y neutrófilos a partir de una sola muestra y su aplicabilidad a otros hongos o bacterias portadoras de paredes celulares. La determinación de porcentajes de leucocitos fagocitos proporciona un medio a los microbiólogos para evaluar la virulencia de un patógeno o para comparar los tipos silvestres patógenos y mutantes, así como a los inmunólogos para investigar las capacidades de leucocitos humanos para combatir patógenos.
Introduction
La aspergilosis pulmonar invasiva es una gran amenaza para los pacientes inmunocomprometidos, ya que las opciones de tratamiento son limitadas y solo tienen éxito tras el diagnóstico precoz, lo que conduce a altas tasas de mortalidad1. Los agentes infecciosos son conidia (esporas) del moho Aspergillus fumigatus que son omnipresentes en la mayoría de los hábitats2. Conidia se inhala, pasa a través de las vías respiratorias y finalmente puede entrar en los alvéolos pulmonares. En los seres humanos inmunocompetentes, estas conidias son borradas por células inmunitarias innatas como monocitos o macrófagos y granulocitos neutrófilos, que toman (fagocitosa) y digieren los patógenos3. La fagocitosis es importante para los microbiólogos e inmunólogos también cuando están interesados en interacciones huésped-patógeno. Los ensayos de confrontación, como la coincubación de leucocitos y conidia, a menudo incluyen el etiquetado de las esporas por fluoresceína o su derivado fluoresceína isotiocianato (FITC). Usando un microscopio, es sencillo identificar la conidia fluorescente internalizada y determinar la conidia adjunta/adherente, aunque este enfoque es engorroso y realistamente restringido a unos cientos de células4. Sin embargo, en la citometría de flujo que permite fácilmente el análisis de cientos de miles de células en cuestión de minutos, la tinción diferencial de la conidia fagocitosed y adherente es vital. Por lo tanto, muchos protocolos dependen de Trypan Blue para saciar la fluorescencia FITC de la conidia5adherente,6,7,8. Otro enfoque es explotar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de bromuro de etidio y FITC para emitir rojo en lugar de fluorescencia verde de conidiaadherente 9,10,11. Si se dispone de anticuerpos específicos, como es el caso de algunas bacterias, las partículas enlazadas a las células se pueden teñir directamente12,13.
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar rápida y cuantitativamente la fagocitosis de A. fumigatus conidia con la etiqueta FITC por leucocitos humanos junto con la unión de esporas a las células y la falta de interacción mediante el empleo de un anticuerpo anti-FITC acoplado con aloficocianina (APC). El método también permite el análisis citométrico de flujo simultáneo de otros marcadores celulares que se pueden emplear para el análisis separado de la fagocitosis por monocitos y neutrófilos de la misma muestra.
El protocolo se puede aplicar para la caracterización de cepas fúngicas (por ejemplo, varias especies de Aspergillus y otros mohos del género Mucorales presentados aquí) y sus mutantes14 e investigación inmunológica sobre fagocitos, como leucocitos de individuos inmunocomprometidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta un método citométrico de flujo rápido para medir la interacción de A. fumigatus conidia con un gran número de leucocitos humanos primarios que no es posible en los protocolos microscópicos comunes. Las células de imagen con un microscopio y el recuento manual de conidias internalizadas son engorrosas y se pueden hacer de forma realista solo para unos pocos cientos de células. La citometría de flujo supera este problema midiendo miles de células en cuestión de minutos. Un obstá…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Pia Stier por su excelente asistencia técnica. M. von Lilienfeld-Toal cuenta con el apoyo del Centro de Control y Cuidado de la Sepsis (Ministerio Federal Alemán de Educación y Salud, BMBF, FKZ 01E01002) y el Campus de Investigación Desinfecciosa (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang cuenta con el apoyo de la Escuela de Comunicación Microbiana de Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
Riferimenti
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
