Summary

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Published: December 07, 2019
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Summary

Este protocolo fornece um método rápido e confiável para medir quantitativamente a fagocitose de Aspergillus fumigatus conidia por phagocitos primários humanos usando citometria de fluxo e para discriminar a fagocitose da conidia de mera adesão a leukócitos.

Abstract

A infecção pulmonar invasora pelo molde Aspergillus fumigatus representa uma grande ameaça para os pacientes imunocomprometidos. Conidia fúngica inalada (esporos) são desmatadas dos avestélios pulmonares humanos por serem fagócitos por monócitos inatos e/ou neutrófilos. Este protocolo oferece uma medida rápida e confiável de fagocitose por citometria de fluxo usando conidia siciana tolice de fluoresceina (FITC) para co-incubação com leukócitos humanos e subsequente contramanchas com anticorpo antiFITC para permitir a discriminação de conidia internada e aderente celular. As principais vantagens deste protocolo são a sua rapidez, a possibilidade de combinar o ensaio com a análise citométrica de outros marcadores celulares de interesse, a análise simultânea de monócitos e neutrófilos de uma única amostra e sua aplicabilidade a outros fungos ou bactérias portadores de parede celular. A determinação de porcentagens de leukócitos de fagocitos fornece um meio aos microbiologistas para avaliar a virulência de um patógeno ou para comparar os wildtypes e os mutantes do micróbio patogénico assim como aos imunologistas para investigar capacidades humanas do leukocyte combater micróbios patogénicos.

Introduction

A aspergillose pulmonar invasiva é uma grande ameaça aos pacientes imunocomprometidos, pois as opções de tratamento são limitadas e só são bem-sucedidas após o diagnóstico precoce, o que leva a altas taxas de mortalidade1. Agentes infecciosos são conidia (esporos) do molde Aspergillus fumigatus que são onipresentes para a maioria dos habitats2. Conidia são inaladas, passam pelas vias aéreas e podem finalmente entrar no pulmão amasso. Em seres humanos imunocompetentes, estes conidia são limpos por células imunes inatas, como monócitos ou macrófagos e grânulos neutrófilos, que ocupam (fagocitose) e digerem os patógenos3. A fagocitose é importante para microbiologistas e imunologistas da mesma forma quando interessado em interações hospedóias-patógenos. Ensaios de confronto, como a co-incubação de leukócitos e conidia, muitas vezes incluem rotulagem dos esporos por fluoresceina ou sua fluoresceina derivada isotiaciana (FITC). Usando um microscópio, é simples identificar conidia fluorescente internalizada e determinar conidia anexada/aderente, embora essa abordagem seja complicada e realisticamente restrita a algumas centenas de células4. No entanto, na citometria de fluxo que facilmente permite a análise de centenas de milhares de células em poucos minutos, a coloração diferencial de conidia fagocitosada e aderente é vital. Portanto, muitos protocolos dependem trypan azul para saciar FITC-fluorescência de conidia adepto5,6,7,8. Outra abordagem é explorar a transferência de energia de ressonância fluorescência de brometo de etídio e FITC para emitir vermelho em vez de fluorescência verde da conidia aderente9,10,11. Se os anticorpos específicos estão disponíveis, como é o caso de algumas bactérias, partículas ligadas à célula podem ser diretamente manchadas12,13.

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar rápida e quantitativamente a fagocitose de FitC-rotulado A. fumigatus conidia por leukócitos humanos, juntamente com o apego de esporos às células e falta de interação, empregando uma alocecianina (APC) acoplado anticorpo anti-FITC. O método também permite a análise citométrica de fluxo simultâneo de marcadores celulares adicionais que podem ser empregados para análise separada da fagocitose por monócitos e neutrófilos da mesma amostra.

O protocolo pode ser aplicado para caracterização de cepas fúngicas (por exemplo, várias espécies de Aspergillus e outros moldes do gênero Mucorales apresentados aqui) e seus mutantes14 e pesquisa imunológica sobre fagócitos, como leukócitos de indivíduos imunocomprometidos.

Protocol

Este protocolo inclui o uso de casacos de buffy humanos obtidos do Instituto de Medicina Transfusional, Hospital Universitário de Jena e sangue venoso fresco retirado dos pacientes, ambos após o consentimento informado por escrito dos doadores de acordo com a aprovação do comitê de ética 4357-03/15. 1. Preparação de Aspergillus fumigatus Conidia Crescer A. fumigatus em 1,5% de malte agar placas de Petri por 5 dias a 37 ° C sem CO2.CUI…

Representative Results

Ao medir a fagocitose de A. fumigatus conidia por células fagocíticas humanas, a discriminação entre internalização genuína e mera fixação de conidia às células é um obstáculo, especialmente quando se trata de métodos de alta audácia, como citometria de fluxo. A fim de superar esse obstáculo, apresentamos um protocolo rápido e confiável com base na coloração de conidia com a corante fluorescente FITC antes da co-incubação de células e conidia, seguido por uma contra-mancha com um anticorpo…

Discussion

Este protocolo apresenta um método citométrico de fluxo rápido para medir a interação de A. fumigatus conidia com um grande número de leukócitos humanos primários que não são possíveis em protocolos microscópicos comuns. As células de imagem com um microscópio e conidia internalizada de contagem manual é complicada e podem ser feitas de forma realista apenas para algumas centenas de células. A citometria do fluxo supera este problema medindo milhares de pilhas dentro dos minutos. Um obstáculo co…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos à Sra. Pia Stier por excelente assistência técnica. M. von Lilienfeld-Toal é apoiado pelo Center for Sepsis Control and Care (Ministério Federal Alemão de Educação e Saúde, BMBF, FKZ 01E01002) e InfectoGnóstics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang é apoiado pela Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Materials

Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

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