Detecteren van de totstandbrenging van gedeelde bloedtoevoer in parabiotische muizen door Caudal Vein Glucose Injection

Summary

Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het opsporen van een succesvolle vaststelling van gedeelde bloedcirculatie van twee parabionten door middel van een caudale ader injectie van glucose, die minimale schade veroorzaakt en is niet fataal voor de parabionts.

Abstract

Parabiose is een experimentele methode voor het chirurgisch combineren van twee parallelle dieren langs de lengteas van het lichaam. We presenteren een protocol voor het opsporen van de succesvolle oprichting van bloedchimerisme in parabionts door een caudal aderinjectie van glucose. Parabiotische muizen werden geconstrueerd. Glucose werd geïnjecteerd in de donormuis door de staartader, en de fluctuatie van de bloedsuikerspiegel werd gemeten bij beide muizen met behulp van een bloedglucometer op verschillende tijdspunten. Onze resultaten toonden aan dat na glucose-injectie het bloedglucoseniveau bij donormuizen na 1 min sterk steeg en daarna langzaam daalde. Ondertussen piekte de bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen 15 min na injectie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Evans blauw, gebruikt als een positieve controle voor glucose. De synchrone fluctuatie van de bloedsuikerspiegel geeft aan dat de bloedstroom tussen de twee muizen met succes werd vastgesteld.

Introduction

Parabiose is een modelleringsmethode waarbij twee levende organismen chirurgisch worden samengevoegd en zich ontwikkelen als één fysiologisch systeem met een gedeelde bloedsomloop¹. Dergelijke modellen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de fysiologie vanwege het voordeel dat de stoffen die door één enkel individu worden geproduceerd, tegelijkertijd via de gedeelde bloedsomloop op beide dieren kunnen werken. Sinds het midden van de jaren 1800, toen parabiotische experimenten werden gepionierd door Paul Bert², zijn de methoden voor de bouw van parabiotische modellen gestandaardiseerd geworden. Echter, een eenvoudige en handige methode voor het verifiëren van de succesvolle oprichting van bloedchimerisme is verdwenen. Er is gemeld dat cross-circulation met succes kan worden beoordeeld door intraperitoneally injecteren 0,5% Evans blauwe kleurstof in een van de parabionten, gevolgd door meting van de absorptie van Evans blauw in het bloed van beide parabionts met een microplate lezer³. Een andere methode vereist een specifiek muisras dat CD45.1⁺– en CD45.2⁺-gelabelde monocyten in elke parabiont bevat. Celcytometrie wordt vervolgens gebruikt om bloedchimerisme te bepalen door de frequentie van de twee markers in monocyten van milt of bloed te meten⁴. Deze methoden zijn echter vaak dodelijk of omslachtig voor de dieren, en een veilige en eenvoudige methode voor snelle en betrouwbare verificatie van parabiotische modellen is zeer wenselijk. In deze studie hebben we hiervoor een nieuwe methode vastgesteld, die werd gevalideerd in een muismodel van parabiose. Glucoseconcentratie in bloedmonsters uit een staartader wordt gemeten met behulp van een glucometer, en het patroon van veranderingen van glucoseniveau bij donor- en ontvangende muizen wordt beschouwd als een indicatie van circulatiechimerisme. We noemden deze methode de “glucose fluctuatiemethode”. De toepassing van deze validatiemethode is niet beperkt tot muizen, maar kan worden uitgebreid tot diverse pathologische modellen, behalve voor modellen met ernstige dysregulatie van het glucosemetabolisme. De procedure is eenvoudig, tijdbesparend en veilig.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren en hun zorg werden goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van de Harbin Medical University. OPMERKING: De gereedschappen en apparatuur die nodig zijn voor de methode zijn opgenomen in de tabel met materialen. 1. Bereiding van materialen en dieren Bestel C57BL/6 mannelijke muizen met een gewicht tussen 20 g-25 g bij een standaard leverancier van laboratoriumdie…

Representative Results

Bij zes donormuizen steeg de bloedsuikerspiegel sterk tot 26,5 μmol/L (173% toename) met een gemiddelde van 1 min na de injectie van 100 μL glucose (1,2 g/kg) door de staartader en daalde vervolgens geleidelijk tot 13,3 mol μ/L bij 60 min. Bij de ontvangende muizen nam de bloedglucose na de injectie langzaam toe en bereikte het eerste piekniveau op 15 min (47% toename, 12,2 μmol/L). Op basis van de bovenstaande resultaten werd de norm voor circulatiechimerisme als volgt vastgesteld: 1…

Discussion

Parabiose verwijst naar de chirurgische techniek om twee levende dieren met elkaar te verbinden om een gemeenschappelijk vasculair systeem op te zetten met experimentele middelen^6,7,8. Het voordeel van dit model is dat de stoffen die door één enkel individu worden geproduceerd tegelijkertijd op beide dieren kunnen werken. Zo kan het parabiosemodel worden gebruikt om de rol van een stof of factor in een verwante ziekte te onder…

Materials

curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#