Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica
Summary
La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.
Abstract
Le cellule cambiano i modelli di migrazione in risposta a stimoli chimici, compresi i gradienti degli stimoli. La migrazione cellulare nella direzione di un gradiente chimico, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante nello sviluppo, nella risposta immunitaria, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro. Mentre la chemiotassi modula la migrazione di singole cellule e raccolte di cellule in vivo, la ricerca in vitro si concentra sulla chemiotassi una singola cellula, in parte a causa della mancanza di strumenti sperimentali adeguati. Per colmare questa lacuna, descritta qui c’è un sistema sperimentale unico che combina microfluidica e micropatterning per dimostrare gli effetti dei gradienti chimici sulla migrazione collettiva delle cellule. Inoltre, la microscopia a trazione e la microscopia a stress monomerio sono incorporate nel sistema per caratterizzare i cambiamenti nella forza cellulare sul substrato e tra le cellule vicine. Come prova di concetto, la migrazione di isole circolari micromodellate di cellule renali canine Madin-Darby (MDCK) è testata sotto un gradiente di fattore di crescita epatociti (HGF), un fattore di dispersione noto. Si trova che le cellule situate vicino alla maggiore concentrazione di HGF migrano più velocemente di quelle sul lato opposto all’interno di un’isola cellulare. All’interno della stessa isola, la trazione cellulare è simile su entrambi i lati, ma lo stress intercellulare è molto più basso sul lato di una maggiore concentrazione di HGF. Questo nuovo sistema sperimentale può fornire nuove opportunità per studiare la meccanica della migrazione chemiotattica da parte dei collettivi cellulari.
Introduction
La migrazione cellulare nei sistemi biologici è un fenomeno fondamentale coinvolto nella formazione dei tessuti, nella risposta immunitaria e nella guarigione delle ferite1,2,3. La migrazione cellulare è anche un processo importante in alcune malattie come il cancro4. Le celle spesso migrano come un gruppo piuttosto che singolarmente, che è noto come migrazione collettiva di celle4,5. Affinché le cellule si muovano collettivamente, il rilevamento del microambiente è essenziale6 . Ad esempio, le cellule percepiscono gli stimoli fisici e reagiscono cambiando motilità, le interazioni tra cellule e substrati e interazioni cellula-cellula, con conseguente migrazione direzionale lungo un gradiente chimico7,8, 9,10. Sulla base di questa connessione, sono stati fatti rapidi progressi nelle tecnologie lab-on-a-chip in grado di creare microambienti chimici ben controllati come il gradiente di un chemioattraente11,12,13 . Mentre queste microfluidiche basate su lab-on-a-chip sono state precedentemente utilizzate per studiare la chemiotassi dell’insieme cellulare o degli sferoidi cellulari14,15,16,17, sono stati utilizzati principalmente nel contesto della migrazione a cella singola18,19,20,21. I meccanismi alla base di una risposta collettiva cellulare a un gradiente chimico non sono ancora ben compresi14,22,23,24,25,26 . Così, lo sviluppo di una piattaforma che consenta il controllo spatiotemporale dei fattori solubili e l’osservazione in situ della biofisica delle cellule aiuterà a svelare i meccanismi alla base della migrazione collettiva delle cellule.
Sviluppato e descritto qui è un sistema microfluidico multicanale che consente la generazione di un gradiente di concentrazione di fattori solubili che modula la migrazione di cluster cellulari modellati. In questo studio, il fattore di crescita dell’epatocite (HGF) è scelto per regolare il comportamento migratorio delle cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK). HGF è noto per attenuare l’integrità delle cellule cellulari e migliorare la motilità delle cellule27,28. Nel sistema microfluidico, sono incorporate anche la microscopia a trazione a trazione e la microscopia a stress del monostrato, che consente l’analisi della motilità, della forza contrattile e della tensione intercellulare indotta dalle cellule costituenti in risposta a un HGF pendenza. All’interno della stessa isola, le cellule situate vicino alla maggiore concentrazione di HGF migrano più velocemente e mostrano livelli di stress intercellulare inferiori rispetto a quelli sul lato con una minore concentrazione di HGF. I risultati suggeriscono che questo nuovo sistema sperimentale è adatto per esplorare altre questioni in campi che coinvolgono la migrazione cellulare collettiva sotto gradienti chimici di vari fattori solubili.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migrazione collettiva delle cellule costitutive è un processo importante durante lo sviluppo e la rigenerazione, e la direzione di migrazione è spesso guidata dal gradiente chimico dei fattori di crescita4,23. Durante la migrazione collettiva, le cellule continuano a interagire con le cellule vicine e i substrati sottostanti. Tali interazioni meccaniche danno origine a fenomeni emergenti come durotaxis42, plithotaxis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (N.. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant e il programma BK 21 Plus. È stato supportato anche dai National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY0196).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
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