Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica
Summary
La migración celular colectiva en el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer a menudo se guía por los gradientes de los factores de crecimiento o moléculas de señalización. Aquí se describe un sistema experimental que combina la microscopía de tracción con un sistema microfluídico y una demostración de cómo cuantificar la mecánica de la migración colectiva bajo gradiente bioquímico.
Abstract
Las células cambian los patrones de migración en respuesta a los estímulos químicos, incluidos los gradientes de los estímulos. La migración celular en la dirección de un gradiente químico, conocido como quimiotaxis, desempeña un papel importante en el desarrollo, la respuesta inmune, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer. Mientras que la quimiotaxis modula la migración de células individuales, así como las colecciones de células in vivo, la investigación in vitro se centra en la quimiotaxis de una sola célula, en parte debido a la falta de las herramientas experimentales adecuadas. Para llenar ese vacío, descrito aquí es un sistema experimental único que combina microfluídicos y micropatrones para demostrar los efectos de los gradientes químicos en la migración de células colectivas. Además, la microscopía de tracción y la microscopía de tensión monocapa se incorporan al sistema para caracterizar los cambios en la fuerza celular en el sustrato, así como entre las células vecinas. Como prueba de concepto, la migración de islas circulares micropatrónizadas de células renales caninas de Madin-Darby (MDCK) se prueba bajo un gradiente de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de dispersión conocido. Se encuentra que las células ubicadas cerca de la mayor concentración de HGF migran más rápido que las del lado opuesto dentro de una isla celular. Dentro de la misma isla, la tracción celular es similar en ambos lados, pero el estrés intercelular es mucho menor en el lado de una mayor concentración de HGF. Este novedoso sistema experimental puede proporcionar nuevas oportunidades para estudiar la mecánica de la migración quimiotáctica por colectivos celulares.
Introduction
La migración celular en sistemas biológicos es un fenómeno fundamental implicado en la formación de tejidos, la respuesta inmune y la cicatrización de heridas1,2,3. La migración celular también es un proceso importante en algunas enfermedades como el cáncer4. Las celdas a menudo se migran como un grupo en lugar de individualmente, lo que se conoce como migración de celdas colectivas4,5. Para que las células se muevan colectivamente, la notorencia del microambiente es esencial6. Por ejemplo, las células perciben estímulos fisicoquímicos y responden cambiando la motilidad, las interacciones célula-sustrato e interacciones célula-célula, lo que resulta en una migración direccional a lo largo de un gradiente químico7,8, 9,10. Sobre la base de esta conexión, se han realizado rápidos avances en tecnologías de laboratorio en chip que pueden crear microambientes químicos bien controlados, como el gradiente de un quimioatractor11,12,13 . Mientras que estos microfluídicos basados en laboratorio en un chip se han utilizado previamente para estudiar quimiotaxis del conjunto celular o esferoides celulares14,15,16,17, se han utilizado principalmente en el contexto de la migración de una sola célula18,19,20,21. Mecanismos subyacentes a una respuesta colectiva celular a un gradiente químico todavía no se entiende bien14,22,23,24,25,26 . Así, el desarrollo de una plataforma que permita el control espaciotemporal de factores solubles, así como la observación in situ de la biofísica de las células, ayudará a desentrañar los mecanismos detrás de la migración celular colectiva.
Desarrollado y descrito aquí es un sistema microfluídico multicanal que permite la generación de un gradiente de concentración de factores solubles que modula la migración de clústeres de células con patrones. En este estudio, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se elige para regular el comportamiento migratorio de las células del riñón canino de Madin-Darby (MDCK). HGF es conocido por atenuar la integridad celular y mejorar la motilidad de las células27,28. En el sistema microfluídico, también se incorporan la microscopía de tracción de transformación de Fourier y la microscopía de tensión monocapa, que permite el análisis de la motilidad, la fuerza contráctil y la tensión intercelular inducida por las células constituyentes en respuesta a un HGF Gradiente. Dentro de la misma isla, las células ubicadas cerca de la mayor concentración de HGF migran más rápido y muestran niveles de estrés intercelular más bajos que aquellos en el lado con menor concentración de HGF. Los resultados sugieren que este nuevo sistema experimental es adecuado para explorar otras cuestiones en campos que implican la migración celular colectiva bajo gradientes químicos de diversos factores solubles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migración colectiva de células constituyentes es un proceso importante durante el desarrollo y la regeneración, y la dirección migratoria a menudo se guía por el gradiente químico de los factores de crecimiento4,23. Durante la migración colectiva, las células siguen interactuando con las células vecinas y sustratos subyacentes. Tales interacciones mecánicas dan lugar a fenómenos emergentes como durotaxis42, plithotaxis<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant y el programa BK 21 Plus. También fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
Riferimenti
- Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
- Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
- Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
- Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
- Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
- Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
- Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
- Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
- Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
- Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
- Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).
