הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.
תאים משנים דפוסי הגירה בתגובה לגירויים כימיים, כולל מעברי הצבע של הגירויים. הגירה סלולרית בכיוון של מעבר הדרגתי כימי, המכונה כימוטקאס, ממלא תפקיד חשוב בפיתוח, התגובה החיסונית, הפצע ריפוי, וגרורות סרטן. בעוד כימוטקסיס מודולים את הגירה של תאים בודדים, כמו גם אוספים של תאים בvivo, במחקר מתורבת מתמקד כימווניות תא יחיד, בחלקו בשל העדר הכלים הניסיוניים הנכונה. כדי למלא את הפער, המתואר כאן הוא מערכת ניסיונית ייחודית המשלבת מיקרופלואידיקה ו מיקרופלנינג כדי להדגים את ההשפעות של מעברי כימיים על הגירה תא קולקטיבי. יתר על כן, מיקרוסקופ המתיחה ומיקרוסקופ הלחץ דופלקס משולבים במערכת כדי לאפיין שינויים בכוח הסלולר על מצע, כמו גם בין תאים שכנים. כהוכחה-of-קונספט, הגירה של האיים העגולים של מיקרותבנית של דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) התאים נבדק תחת הדרגתי של גורם הצמיחה hepatocyte (HGF), גורם פיזור ידוע. הוא נמצא כי תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של HGF להגר מהר יותר מאשר אלה בצד הנגדי בתוך האי תא. בתוך אותו האי, המתיחה הסלולר דומה משני הצדדים, אבל הלחץ הבינתאי הוא הרבה יותר נמוך בצד של ריכוז HGF גבוה. מערכת זו הניסיונית הרומן יכול לספק הזדמנויות חדשות ללמוד את המכניקה של הגירה כימוטקטיק ידי הקולקטיבים הסלולריים.
הגירה סלולרית במערכות ביולוגיות היא תופעה יסודית הכרוכה בהיווצרות רקמות, התגובה החיסונית, וריפוי הפצע1,2,3. הגירה סלולרית הוא גם תהליך חשוב בכמה מחלות כמו סרטן4. תאים לעיתים קרובות עוברים כקבוצה במקום בנפרד, המכונה העברת תאים קולקטיבית4,5. כדי שתאים יזוזו באופן קולקטיבי, חישת המיקרו-סביבה תהיה חיונית ב-6. למשל, תאים תופסים גירויים פיזיקליים ומגיבים על ידי שינוי תנועתיות, אינטראקציות תאים ואינטראקציות תאים, והתוצאה היא הגירה כיוונית לאורך מעבר צבע כימי7,8, 9,10. בהתבסס על הקשר הזה, נעשו התקדמויות מהירות בטכנולוגיות מעבדה על שבב שיכולות ליצור מיקרוסביבות כימיות מבוקרות היטב כגון הדרגתי של כימוסטנט11,12,13 . בעוד המעבדה-on-a-שבב מבוססי מיקרופלואידיקה שימשו בעבר כדי ללמוד כימוטקוניות של האנסמבל הסלולר או spheroids הסלולר14,15,16,17, הם היו בשימוש בעיקר בהקשר של הגירה תא יחיד18,19,20,21. מנגנונים הנמצאים בבסיס תגובה קולקטיבית הסלולר למעבר מעבר כימי עדיין לא מובנים היטב14,22,23,24,25,26 . לפיכך, פיתוח פלטפורמה המאפשרת השליטה הרקתית הטמפורלית של גורמים מסיסים, כמו גם התבוננות באתרו של תאים ‘ ביופיזיקלי יסייע לפענח את המנגנונים מאחורי הגירה תא קולקטיבי.
פיתח ותיאר כאן הוא מערכת מיקרופלואידיג multi-מנותבת המאפשרת את הדור של הדרגתי ריכוז של גורמים מסיסים, כי הגירה מודולים של אשכולות תאים בדוגמת. במחקר זה, מקדם צמיחה hepatocyte (HGF) נבחרה כדי לווסת את התנהגות הנדידה של דין-דארבי כליה כליות (MDCK) תאים. Hgf ידוע להחליש את התאים התא התא ולשפר את תנועתיות התאים27,28. במערכת המיקרופלואידיג, מיקרוסקופ המתיחה של פורייה ומיקרוסקופ מונאולייר משולבים גם הם, המאפשר ניתוח של התנועתיות, כוח כריתת הגוף, והמתח הבינתאי הנגרם על ידי התאים המרכיבים בתגובה ל HGF עבר צבע. בתוך האי זהה, תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של hgf להעביר מהר יותר ולהראות נמוך יותר התרבות רמות הלחץ מאשר אלה בצד עם ריכוז hgf נמוך. התוצאות מרמזות על כך שהמערכת הניסיונית החדשה הזאת מתאימה לחקור שאלות אחרות בתחומים הכרוכים בהעברה סלולרית קולקטיבית תחת מעברי מדרגות כימיים של גורמים מסיסים שונים.
הגירה קולקטיבית של תאים בוחרים הוא תהליך חשוב במהלך פיתוח והתחדשות, וכיוון הנדידה מודרך לעתים קרובות על ידי הדרגה הכימית של גורמי גדילה4,23. במהלך הגירה קולקטיבית, התאים ממשיכים לקיים אינטראקציה עם תאים שכנים ומצעים המשמשים כבסיס. אינטראקציות מכניות כאלה מע…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) המענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (לא. NRF-2017R1A1A01075103), מענק אוניברסיטת קוריאה, ותוכנית BK 21 פלוס. זה היה גם נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |