化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡
Summary
発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。
Abstract
細胞は、刺激の勾配を含む化学刺激に応じて移動パターンを変化させる。化学勾配の方向への細胞移動は、化学的勾配として知られており、発達、免疫応答、創傷治癒、癌転移において重要な役割を果たしている。化学タキシスは、単一細胞の移動と生体内の細胞のコレクションを調節する一方で、インビトロ研究は、適切な実験ツールの欠如のために、単細胞化学タキシスに焦点を当てています。このギャップを埋めるために、ここで説明するマイクロ流体とマイクロパターニングを組み合わせて、集団細胞移動に対する化学勾配の影響を実証するユニークな実験システムを説明します。さらに、トラクション顕微鏡と単層ストレス顕微鏡は、基板上の細胞力の変化を特徴付けるためにシステムに組み込まれ、隣接する細胞間でも変化します。概念実証として、マディン・ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の微小パターン状の円形島の移動は、既知の散乱因子である肝細胞増殖因子(HGF)の勾配の下で試験される。HGFの高濃度付近に位置する細胞は、細胞島内の反対側の細胞よりも速く移動することがわかった。同じ島内では、細胞トラクションは両側で類似しているが、細胞間ストレスはHGF濃度が高い側ではるかに低い。この新しい実験システムは、細胞集団による化学的移動の力学を研究する新しい機会を提供できる。
Introduction
生体系における細胞移動は、組織形成、免疫応答、および創傷治癒1、2、3に関与する基本的な現象である。細胞移動はまた、癌4のようないくつかの疾患で重要なプロセスです。セルは、多くの場合、個別ではなくグループとして移行します。細胞が集合的に移動するためには、微小環境のセンシングが不可欠6.例えば、細胞は物理化学的刺激を知覚し、運動性、細胞基板相互作用、および細胞間相互作用を変化させ、化学勾配7、8に沿った方向移動をもたらし、応答する。 9,10.この接続に基づいて、化学集化剤11、12、13の勾配のようなよく制御された化学微小環境を作成することができるラボオンチップ技術の急速な進歩がなされた.これらのラボ・オン・チップベースのマイクロ流体学は、以前に細胞アンサンブルまたは細胞スフェロイド14、15、16、17の化学タキシスを研究するために使用されてきましたが、単一セル移行18、19、20、21のコンテキストで主に使用されています。化学勾配に対する細胞集合応答の根底にあるメカニズムは、まだよく理解されていない14,22,23,24,25,26.したがって、可溶性因子の時空間制御を可能にするプラットフォームの開発と、細胞の生物物理学のその場観察は、集団細胞移動の背後にあるメカニズムを解明するのに役立つ。
ここで開発および説明されているのは、パターン化された細胞クラスターの移動を調節する可溶性因子の濃度勾配の生成を可能にする多チャネルマイクロ流体システムである。本研究では、肝細胞増殖因子(HGF)がマディン・ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の移動挙動を調節するために選択される。HGFは、細胞の完全性を減衰させ、細胞27、28の運動性を高めることが知られている。マイクロ流体系では、フーリエ変換トラクション顕微鏡と単層ストレス顕微鏡も組み込まれており、HGFに応答して構成細胞によって誘導される運動性、収縮力、および細胞間張力の分析が可能です。グラデーション。同じ島内で、HGFの高濃度付近に位置する細胞はより速く移動し、低いHGF濃度を有する側のものよりも低い細胞間ストレスレベルを示す。この新しい実験システムは、様々な可溶性因子の化学勾配下での集団細胞移動を含む分野における他の疑問を探求するのに適していることを示唆している。
Protocol
注:ステンシル(厚さ= 250 μm)およびマイクロチャネル部品(厚さ=150μm)、ガラスエッチング(深さ=100μm)、鋳造加工のためのSU-8金型のリソグラフィは、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して設計をメーカーに送信することで外部委託されました。 1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)ステンシルおよびマイクロチャネルの製造 ステンシルとマイクロチャネルのマイ?…
Representative Results
化学勾配下での集団移動を探索するために、微小流体システムをトラクション顕微鏡検査と統合した(図1)。統合システムを構築するために、ポリアクリルアミド(PA)ゲルをカスタムカットガラス上に鋳造し、MDCK細胞はPDMSステンシル製のマイクロパターン化された島内に播種した。この実験では、MDCK細胞の12の島(3列で4列、直径約700μm)を作成した。PAゲルに付着した細胞?…
Discussion
構成細胞の集合的な移動は、発達および再生の間に重要なプロセスであり、移行方向はしばしば成長因子4,23の化学勾配によって導かれる。集合的な移行中、セルは隣接するセルや基底の基板と相互作用し続けます。このような機械的相互作用は、デュロタキシス42、プリト軸33、およびキノタキシカル43などの緊?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、韓国政府の助成金を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けました( いいえ)NRF-2017R1E1A1A01075103)、韓国大学助成金、BK 21 Plusプログラム。また、国立衛生研究所(U01CA202123、PO1HL120839、T32HL007118、R01EY019696)によってサポートされました。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).