In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads
Summary
Les complexités tissulaires des systèmes multicellulaires confondent l’identification de la relation causale entre les indices extracellulaires et les comportements cellulaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour étudier le lien direct entre les indices contact-dépendants et les axes de division utilisant des blastomeres d’embryon de C. elegans et des perles adhésives de polystyrène.
Abstract
Dans les systèmes multicellulaires, les cellules individuelles sont entourées par les différents indices physiques et chimiques provenant des cellules voisines et de l’environnement. Cette complexité tissulaire confond l’identification du lien de causalité entre les indices extrinsèques et la dynamique cellulaire. Un système multicellulaire reconstitué synthétiquement surmonte ce problème en permettant aux chercheurs de tester un signal spécifique tout en éliminant les autres. Ici, nous présentons une méthode pour reconstituer des modèles de contact de cellules avec le blastomere isolé de Caenorhabditis elegans et les perles adhésives de polystyrène. Les procédures impliquent l’enlèvement de coquille d’œuf, l’isolement blastomere en perturbant l’adhérence de cellule-cellule, la préparation des perles adhésives de polystyrène, et la reconstitution du contact de cellule-cellule ou de cellule-perle. Enfin, nous présentons l’application de cette méthode pour étudier l’orientation des axes de division cellulaire qui contribue à la régulation du modelage cellulaire spatial et de la spécification du destin cellulaire dans le développement des embryons. Cette méthode in vitro robuste, reproductible et polyvalente permet d’étudier les relations directes entre les modèles de contact cellulaire spatial et les réponses cellulaires.
Introduction
Pendant le développement multicellulaire, les comportements cellulaires (par exemple, l’axe de division) des cellules individuelles sont spécifiés par divers indices chimiques et physiques. Comprendre comment chaque cellule interprète cette information, et comment ils régulent l’assemblage multicellulaire comme une propriété émergente est l’un des objectifs ultimes des études de morphogénèse. L’organisme modèle C. elegans a contribué de manière significative à la compréhension de la régulation au niveau cellulaire de la morphogénèse comme la polarité cellulaire1, la division cellulaire modelant1, la décision du destin cellulaire2, et les règlements à l’échelle des tissus tels que le câblage neuronal3 et l’organogenèse4,5. Bien qu’il existe divers outils génétiques disponibles, les méthodes d’ingénierie tissulaire sont limitées.
La méthode d’ingénierie tissulaire la plus réussie dans l’étude de C. elegans est l’isolement classique de blastomere6; comme l’embryon de C. elegans est entouré d’une coquille d’œuf et d’une barrière de perméabilité7, leur élimination est l’une des principales procédures de cette méthode. Bien que cette méthode d’isolement blastomere permet la reconstitution du contact cellule-cellule d’une manière simplifiée, elle ne permet pas l’élimination des indices indésirables; le contact cellulaire pose toujours à la fois des indices mécaniques (p. ex. adhérence) et chimiques, limitant ainsi notre capacité d’analyser pleinement la relation causale entre le signal et le comportement cellulaire.
La méthode présentée dans cet article utilise des perles de polystyrène modifiés au carboxylate qui peuvent se lier de façon covalente à toutes les molécules réactives à l’amine, y compris les protéines comme ligands. En particulier, nous avons utilisé une forme amine-réactive de Rhodamine Red-X comme un ligand pour faire des perles à la fois visuellement trackable et adhésif à la cellule. Les groupes de carboxyl de surface de perle et les groupes primaires d’amine de molécule de ligand sont couplés par le carbodiimide soluble dans l’eau 1-éthylique-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Les perles adhésives obtenues permettent les effets de la queue mécanique sur la dynamique cellulaire10. Nous avons utilisé cette technique pour identifier les indices mécaniques nécessaires à l’orientation de la division cellulaire10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reconstitution des modèles simplifiés de contact cellulaire permettra aux chercheurs de tester les rôles de modèles de contact cellulaire spécifiques dans différents aspects de la morphogénèse. Nous avons utilisé cette technique pour montrer que l’axe de division cellulaire est contrôlé par le contact physique avec des perles adhésives10. Comme la spécification de l’axe de division est cruciale pour le développement multicellulaire en contribuant à la morphogénèse<sup class="xr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions James Priess et Bruce Bowerman pour leurs conseils et leur fourniture de souches c. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto et Life Sciences Institute Imaging Core Facility pour le partage d’équipement et de réactifs, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim pour l’entretien de C. elegans et la lecture critique de notre manuscrit. Notre travail est appuyé par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
Riferimenti
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