İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerler ve Yapıştırıcı Polistiren Boncuklar ile Mekansal Hücre Temas Desenleri In Vitro Reconstitution
Summary
Çok hücreli sistemlerin doku karmaşıklığı hücre dışı ipuçları ve bireysel hücresel davranışlar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesini şaşırtmak. Burada, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncuklar kullanarak temasa bağlı ipuçları ve bölünme eksenleri arasındaki doğrudan bağlantıyı incelemek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Çok hücreli sistemlerde, tek tek hücreler komşu hücrelerden ve çevreden gelen çeşitli fiziksel ve kimyasal ipuçları ile çevrilidir. Bu doku karmaşıklığı dışsal ipuçları ve hücresel dinamikler arasındaki nedensel bağlantının belirlenmesini bozar. Sentetik olarak yeniden oluşturulmuş çok hücreli sistem, araştırmacıların belirli bir ipucu için test etmesini sağlarken diğerlerini ortadan kaldırarak bu sorunun üstesinden gelir. Burada izole Caenorhabditis elegans blastomer ve yapışkan polistiren boncuklarla hücre temas desenlerini yeniden oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Prosedürler yumurta kabuğu kaldırma, hücre-hücre adezyonu bozarak blastomer izolasyonu, yapışkan polistiren boncuk hazırlanması ve hücre-hücre veya hücre-boncuk temas reconstitution içerir. Son olarak, embriyoların geliştirilmesinde uzamsal hücresel desenleme ve hücre kaderi özelliklerinin düzenlenmesine katkıda bulunan hücresel bölünme eksenlerinin yönünü araştırmak için bu yöntemin uygulanmasını saklı atıyoruz. Bu sağlam, tekrarlanabilir ve çok yönlü in vitro yöntemi uzamsal hücre temas desenleri ve hücresel yanıtlar arasındaki doğrudan ilişkilerin incelenmesini sağlar.
Introduction
Çok hücreli gelişim sırasında, tek tek hücrelerin hücresel davranışları (örneğin, bölünme ekseni) çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları ile belirtilir. Tek tek hücrenin bu bilgiyi nasıl yorumladığını ve çok hücreli montajı acil bir özellik olarak nasıl düzenlediklerini anlamak morfogenez çalışmalarının nihai hedeflerinden biridir. Model organizma C. elegans hücre polaritesi gibi morfogenezin hücresel düzeyde düzenlenmesinin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur1, hücre bölünmesi desenleme1, hücre kader kararı2, ve nöronal kablolama gibi doku ölçekli düzenlemeler3 ve organogenez4,5. Çeşitli genetik araçlar mevcut olmasına rağmen, doku mühendisliği yöntemleri sınırlıdır.
C. elegans çalışmasında en başarılı doku mühendisliği yöntemi klasik blastomerizolasyonu 6; C. elegans embriyo bir yumurta kabuğu ve geçirgenlikbariyer7ile çevrili olduğu gibi, bunların kaldırılması bu yöntemin ana prosedürleri biridir. Bu blastomer izolasyon yöntemi hücre-hücre temasının basitleştirilmiş bir şekilde yeniden yapılandırılmasını sağlarken, istenmeyen ipuçlarının ortadan kaldırılmasına izin vermez; hücre teması hala hem mekanik (örneğin, yapışma) hem de kimyasal ipuçları nı oluşturur ve bu da işaret ile hücresel davranış arasındaki nedensel ilişkiyi tam olarak analiz etme yeteneğimizi sınırlandırır.
Bu yazıda sunulan yöntem, ligand olarak proteinler de dahil olmak üzere herhangi bir amin-reaktif moleküllere kovalent bağlanabilen karboksilit modifiye polistiren boncuklar kullanmalıdır. Özellikle, rhodamine Red-X’in amin-reaktif formunu kullanarak boncukları hem görsel olarak izlenebilir hem de hücreye yapıştırıcı hale getirmek için kullandık. Boncuk yüzeyi karboksil grupları ve ligand molekülünün primer amin grupları suda çözünen karbodiimid 1-etil-3-(dimethylaminoproyl) karbodiimide (EDAC)8,9ile birleştiğindedir. Elde edilen yapışkan boncuklar hücresel dinamikleri10mekanik işaret etkileri için izin verir. Hücre bölünmesi oryantasyonu10için gerekli mekanik ipuçlarını tanımlamak için bu tekniği kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basitleştirilmiş hücre temas kalıplarının yeniden yapılandırılması, araştırmacıların morfogenezin farklı yönlerindeki belirli hücre temas modellerinin rollerini test etmesini sağlayacaktır. Bu tekniği, hücre bölünmesi ekseninin yapışkan boncuklar 10 ile fiziksel temas tarafından kontrol altında olduğunu göstermek içinkullandık. Bölünme ekseni belirtimi morfogenez14katkıda bulunarak çok hücreli gelişim için çok önemli olduğu gibi , k?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tavsiye için James Priess ve Bruce Bowerman teşekkür ve C. elegans suşları, Don Moerman, Kota Mizumoto ve Yaşam Bilimleri Enstitüsü Görüntüleme Çekirdek Tesisi ekipman ve reaktifler, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim C. elegans bakımı ve el yazması eleştirel okuma paylaşımı için sağlayan. Çalışmalarımız Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), (RGPIN-2019-04442) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
Riferimenti
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
