القياس الكمي للخلايا التكاثرية والميتة في Enteroids
Summary
يستخدم البروتوكول المقدم قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد الخلايا المتكاثرة والميتة في مُدخلات الماوس المستزرعة. هذه الطريقة مفيدة لتقييم آثار العلاج بالعقاقير على انتشار الأعضاء والبقاء على قيد الحياة.
Abstract
يعمل ظهارة الأمعاء كحاجز يمنع المحتويات المضيئة ، مثل الميكروبات المسببة للأمراض والسموم ، من دخول بقية الجسم. وظيفة الحاجز الظهاري يتطلب سلامة الخلايا الظهارية المعوية. في حين أن انتشار الخلايا الظهارية يحافظ على طبقة مستمرة من الخلايا التي تشكل حاجزا، يؤدي الضرر الظهاري إلى خلل في الحواجز. ونتيجة لذلك، يمكن للمحتويات المضيئة عبر الحاجز المعوي عبر مسار غير مقيد. وقد ارتبط خلل الحاجز المعوي مع العديد من الأمراض المعوية، مثل مرض التهاب الأمعاء. يمكن استزراع سراديب معوية معزولة للفأرة والحفاظ عليها كهياكل تشبه السرداب ، والتي يطلق عليها الأعضاء المعوية أو “enteroids”. Enteroids مثالية لدراسة انتشار وموت الخلايا الظهارية المعوية في المختبر. في هذا البروتوكول، نصف طريقة بسيطة لتحديد عدد الخلايا التكاثرية والميتة في enteroids المستزرعة. وتستخدم 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ويوديد البروبيديوم لتسمية الخلايا المنتشرة والخلايا الميتة في enteroids، ثم يتم تحليل نسبة الخلايا المنتشرة والميتة عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا هو أداة مفيدة لاختبار آثار العلاج بالعقاقير على انتشار الخلايا الظهارية المعوية وبقاء الخلايا.
Introduction
وظيفة أساسية للخلايا الظهارية المعوية هي حماية دخول المحتويات المضيئة مثل البكتيريا المسببة للأمراض والسموم1،2. لأداء مثل هذه الوظيفة ، تتكاثر الخلايا الجذعية المعوية باستمرار وتفرق في مجموعة متنوعة من الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا المعوية والخلايا الإفرازية ، والتي تشكل حاجزًا عن طريق تشكيل اتصالات ضيقة3. التجديد السريع للخلايا الظهارية المعوية يتطلب تنسيقا صارما من انتشار الخلايا، تمايز الخلايا، وموت الخلية4،5. انخفاض انتشار الخلايا أو الموت المفرط للخلايا يؤدي إلى تلف الظهارية ووظيفة الحاجز للخطر1،6. وقد ارتبط خلل في حاجز الأمعاء مع أمراض الأمعاء الالتهابية7،8.
وقد وضعت طريقة لثقافة سراديب المعوية سابقا. باستخدام هذه التقنية ، تنمو سراديب الماوس المعزولة إلى أعضاء معوية (enteroids) ، والتي تحتوي على تشفير villus مثل الهياكل وتحتوي على جميع نسب الخلايا الظهارية المعوية9،10. 5-إيثينل-2′-ديوكسيوريدين (EdU) هو تناظري ثيميدين قادر على استبدال الثيامين (T) في الحمض النووي الذي يخضع للتكرار أثناء انتشار الخلايا. يمكن تسمية الخلايا التكاثرية بسرعة ودقة من قبل تلطيخ EdU. يوديد البروبيديوم (PI) هو تناظري من بروميد الإيتيديوم الذي يطلق الفلورسينالأحمر عند إدخاله في الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. يكشف PI على وجه التحديد الخلايا الميتة ، لأنه يمر فقط من خلال غشاء الخلية التالفة.
في هذا البروتوكول، ونحن أولا وصف كيفية عزل سراديب من الأمعاء الدقيقة المورين ثم ثقافة لهم كما enteroids في المختبر. ثم نصف كيفية تحليل الخلايا التكاثرية والميتة في enteroids من قبل EdU وPI التأسيس والتدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة لثقافة enteroids في المختبر والقياس الكمي للخلايا EdU- و PI إيجابية في enteroids عن طريق قياس التدفق الخلوي. وهناك عدة مزايا لهذه الاستراتيجية. أولاً، يتم استخدام وضع العلامات EdU للكشف عن الخلايا المنتشرة في enteroids. بالمقارنة مع اختبار BrdU التقليدي ، فإن طريقة وضع ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31971062، 31900326، و 31601022)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20190043، BK20180838)، صندوق البحوث من مختبر الدولة الرئيسية للتكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، جامعة نانجينغ (KF-GN-202004). مؤسسة العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين (19KJB320003)، وبرنامج سبل العيش والتكنولوجيا في مدينة سوتشو (SYS2019030)، وبرنامج الابتكار البحثي لخريجي الجامعات في مقاطعة جيانغسو (KYCX19-1981) . ويدعم هذا العمل أيضا تانغ الباحث من جامعة سوهو.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
