Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides
Summary
El protocolo presentado utiliza citometría de flujo para cuantificar el número de células muertas y proliferantes en enteroides de ratón cultivados. Este método es útil para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación y supervivencia de los organoides.
Abstract
El epitelio intestinal actúa como una barrera que impide que el contenido luminal, como la microbiota patógena y las toxinas, entre en el resto del cuerpo. La función de barrera epitelial requiere la integridad de las células epiteliales intestinales. Mientras que la proliferación de células epiteliales mantiene una capa continua de células que forma una barrera, daño epitelial conduce a la disfunción de barrera. Como resultado, el contenido luminal puede atravesar la barrera intestinal a través de una vía sin restricciones. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con muchas enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal. Las criptas intestinales aisladas del ratón se pueden cultivar y mantener como estructuras similares a la cripta, que se denominan organoides intestinales o “enteroides”. Los enteroides son ideales para estudiar la proliferación y muerte celular de las células epiteliales intestinales in vitro. En este protocolo, describimos un método simple para cuantificar el número de células proliferativas y muertas en enteroides cultivados. 5-etil-2′-desoxiuridina (EdU) y yoduro de propidium se utilizan para etiquetar células proliferantes y muertas en enteroides, y la proporción de células muertas y proliferantes se analizan por citometría de flujo. Esta es una herramienta útil para probar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación de células epiteliales intestinales y la supervivencia celular.
Introduction
Una función fundamental de las células epiteliales intestinales es proteger la entrada de contenidos luminales como bacterias patógenas y toxinas1,2. Para realizar tal función, las células madre intestinales proliferan y diferencian continuamente en una variedad de células epiteliales, incluyendo enterocitos y células secretoras, que forman una barrera mediante la formación de conexiones estrechas3. La rápida renovación de las células epiteliales intestinales requiere una estricta coordinación de la proliferación celular, la diferenciación celular y la muerte celular4,5. La reducción de la proliferación celular o la muerte celular excesiva conduce a daño epitelial y función de barrera comprometida1,6. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con enfermedades inflamatorias intestinales7,8.
Un método para cultivar criptas intestinales ha sido desarrollado previamente. Usando esta técnica, las criptas de ratón aisladas crecen en organoides intestinales (enteroides), que tienen estructuras similares a criptas y contienen todo el linaje celular epitelial intestinal9,10. 5-Etil-2′-desoxiuridina (EdU) es un análogo de timidina que es capaz de reemplazar la timina (T) en el ADN que se está replicando durante la proliferación celular. Las células proliferativas pueden ser etiquetadas rápida y precisamente por la tinción edU. El yoduro de propiduro (PI) es un análogo del bromuro de etidio que libera fluorescencia roja al insertarse en ADN de doble cadena. PI detecta específicamente las células muertas, ya que sólo pasa a través de la membrana celular dañada.
En este protocolo, primero describimos cómo aislar las criptas del intestino delgado murino y luego cultivarlas como enteroides in vitro. A continuación, describimos cómo analizar las células proliferativas y muertas en los enteroides por la incorporación de EdU y PI y la citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalla los pasos necesarios para el cultivo de enteroides in vitro y la cuantificación de células EdU y PI-positivas en los enteroides por citometría de flujo. Hay varias ventajas de esta estrategia. En primer lugar, el etiquetado EdU se utiliza para detectar células que proliferan en enteroides. En comparación con el ensayo tradicional de BrdU, el método de etiquetado EdU es más rápido, más sensible y más preciso. EdU es muy similar a la timina (T), que reemplaza la timina en la síntesis de AD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971062, 31900326 y 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Universidad de Nanjing (KF-GN-202004). La Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior Jiangsu de China (19KJB320003), el Programa de Vida y Tecnología de la Ciudad de Suzhou (SYS2019030), y el Programa de Innovación en Investigación para Graduados Universitarios de la Provincia de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabajo también cuenta con el apoyo de Tang Scholar de la Universidad de Soochow.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
