肠内增殖细胞和死细胞的定量
Summary
提出的协议使用流细胞测定来量化培养小鼠肠细胞中的增殖和死细胞数量。该方法有助于评价药物治疗对器官增殖和存活的影响。
Abstract
肠道上皮作为屏障，阻止光质成分，如致病微生物群和毒素，进入身体的其余部分。上皮屏障功能需要肠道上皮细胞的完整性。上皮细胞增殖维持一个连续的细胞层，形成屏障，上皮损伤导致屏障功能障碍。因此，发光物可以通过不受限制的路径穿过肠道屏障。肠道屏障功能障碍与许多肠道疾病有关，如炎症性肠病。分离的小鼠肠道墓穴可以培养和维持为隐晦状结构，称为肠道器官或”肠状物”。肠类是研究肠道上皮细胞在体外增殖和细胞死亡的理想选择。在这个协议中，我们描述了一种简单的方法来量化培养的肠细胞中的增殖细胞和死细胞的数量。5-ethynyl-2′-脱氧尿碱（EdU）和碘化钠用于标记肠子中的增殖和死细胞，然后通过流动细胞学分析增殖和死细胞的比例。这是一个有用的工具，以测试药物治疗对肠道上皮细胞增殖和细胞生存的影响。
Introduction
肠道上皮细胞的一个基本功能是保护光细胞的进入，如致病菌和毒素1，2。为了发挥这种功能，肠道干细胞不断增殖和分化成各种上皮细胞，包括肠细胞和分泌细胞，它们通过形成紧密的连接形成屏障3。肠道上皮细胞的快速更新需要严格协调细胞增殖、细胞分化和细胞死亡4、5。细胞增殖减少或细胞过度死亡会导致上皮损伤和屏障功能受损1，6。肠道屏障功能障碍与炎症性肠病7、8有关。
以前已经开发出一种培养肠道墓穴的方法。使用这种技术，分离的小鼠密码生长成肠道器官（肠状体），具有像结构一样的隐液，并包含所有肠道上皮细胞系9，10。5-Ethynyl-2′-脱氧尿碱（EdU）是一种胸腺素模拟物，能够取代在细胞增殖过程中正在复制的DNA中的胸腺素（T）。增殖细胞可以通过EdU染色快速准确地标记。碘化钠（PI）是溴化铀的模拟，在插入双链DNA后释放红色荧光。PI 专门检测死细胞，因为它只通过受损的细胞膜。
在这个协议中，我们首先描述如何从鼠小肠中分离出墓穴，然后在体外将它们培养成肠状体。然后，我们描述了如何通过EdU和PI结合和流动细胞学分析肠细胞中的增殖细胞和死细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议详细说明了在体外培养肠子的必要步骤，并通过流式细胞测定对肠细胞中的EdU和PI阳性细胞进行定量。这种策略有几个优点。首先，EdU标签用于检测肠细胞中的增殖细胞。与传统的BrdU测定法相比，EdU标签方法更快、更灵敏、更准确。EdU与胸腺素（T）非常相似，在细胞分裂期间，在DNA合成中取代胸腺素。与BrdU抗体相比，EdU更容易扩散到细胞中，EdU的检测不需要DNA变性和抗原抗体反应。其次?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（31971062、31900326、31601022）、江苏省自然科学基金（BK20190043、BK20180838）、药物生物技术国家重点实验室研究基金、江苏省自然科学基金、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、中国科学院、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学、科技攻关、科技攻关计划、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金南京大学（KF-GN-202004）。中国江苏省高等院校自然科学基金（19KJB320003）、苏州市民生与技术计划（SYS2019030）和江苏省高校毕业生研究创新计划（KYCX19-1981）.这项工作也得到了苏中大学的唐学者的支持。
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
