从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清衍生的外源体对小型非编码RNA进行测序
Summary
治疗阻力经常在晚期前列腺癌患者中发展，在某些情况下，癌症进展到一种称为神经内分泌前列腺癌的致命亚型。评估促进这种转变的微小非编码RNA介导的分子变化，将有助于更好地进行疾病分层，并识别导致神经内分泌前列腺癌发展的因果机制。
Abstract
雄激素受体（AR）的消融信号通过雄激素剥夺是前列腺癌治疗的第一线，最初导致癌症回归的目标。然而，在大量病例中，该疾病进展于晚期、抗割礼性前列腺癌（CRPC），其治疗选择有限，而且往往具有攻击性。远转移主要观察到在侵略性疾病的这个阶段。CRPC由第二代AR通路抑制剂治疗，最初提高存活率，随后出现治疗阻力。神经内分泌前列腺癌 （NEPC） 是前列腺癌 （PCa） 的罕见变体，通常通过称为神经内分泌分化 （NED） 的变性过程，通过治疗阻力而发展，其中 PCa 细胞经历一个系接开关从腺癌，并显示神经内分泌 （NE） 血统标记的表达增加.除了驱动NEPC进展和分化的基因组变化外，表观遗传因子和微环境线索被认为是推动疾病进展的重要因素。本手稿提供了详细的协议，用于识别与高级 PCa 相关的表观遗传驱动因素（即小型非编码 RNA）。使用来自正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 转移组织和相应血清衍生的细胞外囊泡 （EV） 的纯化微RNA，该协议描述了如何为测序准备具有适当质量控制的库来自这些样本来源的微RNA。从FFPE和EV中分离RNA通常具有挑战性，因为大部分RNA要么降解，要么数量有限。该协议将详细阐述优化RNA输入和cDNA库的不同方法，在测序时产生最具体的读取和高质量的数据。
Introduction
前列腺癌是由雄激素通过AR信号作用的驱动。因此，瞄准AR通路是治疗疾病的主要途径1。然而，由于靶向疗法，抗药性往往随之而来，疾病发展到晚期转移性CRPC2。CRPC由第二代AR治疗，包括苯甲酰胺和阿比拉酮2，3，最初提高存活率。然而，致命变种，如NEPC经常出现在25-30%的治疗CRPC病例，有有限的治疗选择，导致死亡率增加3。NEPC通过称为NED的可逆的分化过程出现，其中PCa细胞经历从腺癌的谱系开关，并显示AR的表达减少和NE系谱标记的表达增加，包括乙烷2（ENO2），色球素A（CHGA）和突触素（SYP）4。鉴于这些抗药性变异是治疗干预的结果，因此必须破译导致产生这种致命、难以治疗的PCa形式的途径。
最近，贝尔特兰等人进行的一项详尽研究破译了NEPC的基因组学，其中分析了拷贝数的改变、突变、单核苷酸多态性（SNPs）和来自患者衍生转移组织的DNA甲基化。尽管在了解这种侵略性形式的PCa的基因组学方面取得了显著进展，但人们对表观遗传因素知之甚少，包括参与CRPC-腺癌向NEPC过渡的小型非编码RNA（微RNA）。微RNA（miRNA）是22bp长的双链RNA，主要通过抑制基因表达，通过序列特异性相互作用与3’未翻译区域（UtRs）的共和mRNA目标6。现已发现几种肿瘤抑制剂和肿瘤抑制剂，它们在调节疾病发病和转移中的作用已在不同癌症中得到了很好的研究。这些小型非编码RNA经常作为控制疾病死亡率的非常重要的目标6，8，9。最近的研究集中在了解miRNA在癌症转移中的副体效应，通过它们在EV中的传输，如外生体，在血液中流动，并允许肿瘤细胞发送这些二次信使转移到转移位置在无核酸酶环境10，11，12。EV携带来自肿瘤细胞的miRNA，从宿主细胞12转移转化效应。因此，将EV识别为肿瘤细胞的二次信使，对于非侵入性疾病严重程度的检测非常有用。
miR-1246在来自腐蚀性PCa的EV中高度调节，它表明疾病严重程度为13。这些与EV相关的miRNA不仅作为该病的非侵入性生物标志物，而且在推动肿瘤发生方面起着重要的作用。因此，必须了解与抗性形式的PCa相关的miRNA表谱的重要性，以便更好地识别非侵入性生物标志物及其功能意义。
下一代测序的出现为研究肿瘤景观的细节提供了最全面的平台，涉及基因组的改变，如突变、染色体重新定位、染色体分治和甲基化，所有这些都对癌症14、15、16的形式和性质有重大贡献。同样，它也是一个必要的工具，以了解发生在肿瘤细胞的巨大表观基因组变化，往往是疾病严重程度17的重要参与者。为了了解与NEPC的产生相关的miRNA谱系，对FFPE转移性CRPC组织及其相应的血清衍生EV进行了小RNA测序。从这两个样本源之一衍生的RNA是（1）产量低和（2）质量不良，由于形式固定和EV分离通常发生降解。此外，生成 cDNA 库是测序运行的关键但繁琐的步骤。因此，分离这些RNA并使用它们生成小RNA测序库的方法需要优化才能生成准确可靠的数据。
有几种方法可以分析不同样品中的miRNA表达，包括RT-PCR、微阵列和原位杂交（ISH）。使用FFPE组织衍生RNA评估RT-PCR和ISH的miRNA表达的协议最近发表于18。较新的技术为在样本中分析 miRNA 表达提供了更详尽和更全面的平台。NanoString nCounter 提供一个敏感的 miRNA 检测平台19，但检测通常受到阵列中可用的 miRNA 数量的限制（+2，000）。在这种情况下，一个更敏感和详尽的平台，如下一代测序提供了更广泛的深度的miRNA识别和同时分析在不同的样本20。该方法已用于确定来自PCa患者21、22、23的尿液或血浆中的miRNA特征。在本篇文章中，提出了使用下一代测序平台研究使用FFPE组织和血清衍生EVRNA与腐蚀性CRPC相关的miRNA曲线的协议。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文中，我们将描述一种使用经过优化以提高分离RNA的产量和质量的试剂盒从FFPE组织和血清衍生EV中分离RNA的协议。此外，纯化RNA用于生成用于小RNA测序的cDNA库。列出的两个步骤对于确定排序读取的质量和深度都至关重要，而排序读取是运行24的最终结果。因此，优化这些关键步骤对于成功的测序运行至关重要。
FFPE衍生RNA分离的一个重要步骤是用蛋白酶K…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国陆军医学研究获取活动（USAMRAA）的支持，该奖通过”创意发展奖”获得第1号。W81XWH-18-1-303 和 W81XWH-18-2-0013，此外还有第 1 号奖。W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018 和 W81XWH-18-2-0019 前列腺癌生物储存库网络 （PCBN）。国家卫生研究院国家癌症研究所（批准编号RO1CA177984）对作者实验室的资助也得到了承认。Rajvir Dahiya 是退伍军人事务部的高级研究职业科学家，BX004473，由 NIH-UO1CA199694 （RD） 资助。意见、解释、结论和建议是作者的意见、解释、结论和建议，不一定得到国防部或美国陆军的认可。我们感谢朱迪·希格纳加，旧金山VAMC核心设施总监，她协助下Seq 500音序器。
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
Riferimenti
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Ricerca sul cancro. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Ricerca sul cancro. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
