Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi
Summary
Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.
Abstract
Androjen reseptörünün ablasyon (AR) androjen yoksunluğu ile sinyal başlangıçta kanser regresyon ile sonuçlanan prostat kanseri için tedavinin ilk satırının hedefidir. Ancak, vakaların önemli sayıda, hastalık ileri ilerlemiş ilerler, hadım dirençli prostat kanseri (CRPC), hangi sınırlı tedavi seçenekleri vardır ve genellikle agresif. Uzak metastaz çoğunlukla agresif hastalığın bu aşamasında gözlenir. CRPC başlangıçta sağkalımı artırmak AR yol inhibitörleri ikinci nesil tarafından tedavi edilir, tedavi direnci ortaya çıkması takip. Nöroendokrin prostat kanseri (NEPC), nöroendokrin farklılaşma (NED) olarak bilinen bir transfarklısiasyon süreci ile tedavi direnci nin bir sonucu olarak sıklıkla gelişen prostat kanserinin (PCa) nadir bir çeşididir ve pca hücreleri bir soy değişimine uğrar. adenokarsinomlardan ve nöroendokrin (NE) soy belirteçlerinin artmış ekspresyonu gösterir. NEPC’ye ilerleme ve transdifferentiasyonu yönlendiren genomik değişikliklere ek olarak, epigenetik faktörler ve mikroçevresel ipuçları hastalığın ilerlemesini niçin yönlendiren temel oyuncular olarak kabul edilir. Bu el yazması, gelişmiş PCa ile ilişkili epigenetik sürücüleri (yani, kodlamayan küçük RNA’ları) tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) metastatik dokulardan ve buna karşılık gelen serum kaynaklı ekstrasellüler veziküllerden (EVs) saflaştırılmış mikroRNA’lar kullanan protokol, sıralama için uygun kalite kontrolüne sahip kütüphanelerin nasıl hazırlanacağını açıklar. bu örnek kaynaklardan mikroRNA’lar. RNA’yı hem FFPE hem de EVs’den yalıtmak genellikle zordur, çünkü çoğu bozulmuş tur veya miktar olarak sınırlıdır. Bu protokol, sıralama da en özel okumave yüksek kaliteli verileri elde etmek için RNA girişlerini ve cDNA kitaplıklarını optimize etmek için farklı yöntemler üzerinde ayrıntılı olacaktır.
Introduction
Prostat kanseri AR sinyalizasyon yoluyla hareket androjenler tarafından tahrik edilir. Bu nedenle, AR yolu hedefleme hastalık için dayanak tedavi1. Ancak, direnç genellikle hedeflenen tedaviler in bir sonucu olarak ortaya çıkar ve hastalık ileri metastatik CRPC2ilerler. CRPC başlangıçta sağkalımı artırır enzalutamide ve abiraterone2,3 içeren AR tedavisinin ikinci nesil tarafından tedavi edilir. Ancak, NEPC gibi öldürücü varyantlar genellikle tedavi seçenekleri sınırlı olan tedavi edilen CRPC olgularının %25−30’unda ortaya çıkar ve mortalite artışına yol açar3. NEPC NED olarak bilinen bir geri dönüşümlü transfarklısyon süreci ile ortaya çıkar, PCa hücreleri adenokarsinomlardan bir soy anahtarı geçmesi ve AR azalmış ekspresyonu ve enolase 2 dahil OLMAK ÜZERE NE soy belirteçleri artan ekspresyonu göstermek 2 (ENO2), kromogranin A (CHGA), ve sinaptophysin (SYP)4. Bu direnç varyantları terapötik müdahaleler sonucunda ortaya çıkar göz önüne alındığında, bu ölümcül nesil yol açan yolları deşifre etmek esastır, PCa formu tedavi etmek zor.
NEPC’nin genomik leri yakın zamanda Beltran ve arkadaşları tarafından yapılan kapsamlı bir çalışmada deşifre edilmiştir ve kopya numarası değişiklikleri, mutasyonlar, tek nükleotit polimorfizmleri (SNP) ve hasta kaynaklı metastatik dokulardan DNA metilasyon 5 analizedilmiştir. PCa’nın bu agresif formunun genomiklerinin anlaşılmasında ki önemli ilerlemeye rağmen, CRPC-adenokarsinomunun NEPC’ye geçişinde rol oynayan küçük kodlamayan RNA’lar (mikroRNA’lar) dahil olmak üzere epigenetik faktörler hakkında çok az şey bilinmektedir. MicroRNA’lar (miRNA’lar) 22 bp uzunluğunda, çift iplikli RNA’lardır ve öncelikle gen ekspresyonunu transkripsiyon eliyle baskılayarak 3′-çevrilmemiş bölgelerle (UTR) diziye özgü etkileşimler yaparak hareket eden mRNA hedefleri6′dır. Birkaç oncomiRs ve tümör baskılayıcılar şimdi tespit edilmiştir, ve hastalık başlangıçlı ve metastaz düzenleyen rollerini de farklı kanserlerde çalışılmıştır6,7. Bu küçük kodlamaz RNA’lar genellikle hastalık mortalite6,8,9kontrolünde çok önemli hedefler olarak hizmet vermektedir. Daha yeni araştırmalar, kanser metastazında miRNA’ların parakrin etkilerini anlamak üzerine odaklanmıştır, örneğin ekzozomlar, kan dolaşımında akan ve tümör hücrelerinin bu ikincil habercileri çekirdeksiz bir ortamda metastatik yerlere göndermesine izin vermek10,11,12. EVs ev sahibi hücrelerden dönüştürücü etkileri aktarmak için tümör hücrelerinden miRNA’lar taşır12. Bu nedenle, tümör hücrelerinin ikincil habercileri olarak EVs belirlenmesi hastalığın şiddetinin noninvaziv tespitiyararlı olabilir.
MiR-1246 agresif PCa’lardan evs son derece upregulated, ve hastalığın şiddetini gösterir13. Bu EV ilişkili miRNA’lar sadece hastalığın noninvaziv biyobelirteçleri olarak hizmet değil, aynı zamanda tümörigenez sürüş işlevsel olarak önemli roller oynamaktadır. Bu nedenle, noninvaziv biyobelirteçlerin daha iyi tanımlanmasına ve işlevsel önemine olanak sağlamak için PCa’nın dirençli formları ile ilişkili miRNA repertinin önemini anlamak önemlidir.
Yeni nesil sıralama gelişiyle mutasyonlar, kromozomal tehsülasyonlar, kromotomal tehkisler ve metilasyon gibi genom değişiklikleri içeren tümör manzara ayrıntılarını incelemek için en kapsamlı platform sundu, bunların hepsi kanser in formu ve doğasına önemli ölçüde katkıda14,15,16. Aynı şekilde, aynı zamanda bir tümör hücresinde meydana gelen ve genellikle hastalık şiddeti önemli oyuncular olan büyük epigenomik değişiklikleri anlamak için önemli bir araçtır17. NEPC üretimi ile ilişkili miRNA repertuarının anlaşılması amacıyla FFPE metastatik CRPC dokuları ve buna karşılık gelen serum kaynaklı EV’lerde küçük RNA dizilimi yapılmıştır. Bu iki örnek kaynaktan birinden elde edilen RNA verimi (1) düşük ve (2) formalin fiksasyonu ve EV izolasyonu nedeniyle sıklıkla oluşan bozulmanedeniyle kötü kalitededir. Ayrıca, cDNA kitaplıkları oluşturmak kritik, ama hantal, bir sıralama çalışmasının adımıdır. Bu nedenle, bu RNA’ları yalıtmak ve bunları küçük RNA sıralamaiçin kitaplıkoluşturmak için kullanmak için yöntemler doğru ve güvenilir veri oluşturmak için optimizasyon gerektirir.
RT-PCR, mikrodiziler ve yerinde hibridizasyon (ISH) dahil olmak üzere farklı örneklerde miRNA ekspresyonu profillemek için çeşitli yöntemler vardır. RT-PCR ve ISH tarafından miRNA ekspresyonu değerlendirmek için FFPE doku kaynaklı RNA kullanarak bir protokol son zamanlarda18yayınlandı . Daha yeni teknolojiler, bir örnekte miRNA ifadesini profilleme için daha kapsamlı ve kapsamlı platformlar sunar. NanoString nCounter hassas bir miRNA algılama platformu19sunar, ancak algılama genellikle dizi (~ 2.000) mevcuttur miRNA sayısı ile sınırlıdır. Böyle bir senaryoda, yeni nesil sıralama gibi daha hassas ve ayrıntılı bir platform miRNA tanımlama ve farklı örneklerde eşzamanlı profilleme çok daha geniş bir derinlik sunuyor20. Yöntem PCa hastalarından idrar veya plazma da miRNA izlerini belirlemek için kullanılmıştır21,22,23. Mevcut makalede, ffpe dokuları ve serum kaynaklı EV RNA’lar kullanarak agresif CRPC ile ilişkili miRNA profillerini incelemek için yeni nesil bir sıralama platformu kullanmak üzere bir protokol sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, izole RNA’ların verimini ve kalitesini artırmak için optimize edilmiş kitleri kullanarak RNA’yı FFPE dokularından ve serum kaynaklı EV’lerden izole eden bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, saflaştırılmış RNA’lar küçük RNA dizilimi için cDNA kitaplıkları oluşturmak için kullanılmıştır. Listelenen adımların her ikisi de,24’ünnihai sonucu olan sıralama okumalarının kalitesini ve derinliğini belirlemede gereklidir. Bu nedenle, bu önemli adımları optimiz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Edinme Aktivitesi (USAMRAA) tarafından Fikir Geliştirme Ödülü altında Ödül No ile desteklenir. W81XWH-18-1-303 ve W81XWH-18-2-0013 ve ayrıca Ödül no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 ve W81XWH-18-2-0019 Prostat Kanseri Biyorepozitory Network (PCBN). Ulusal Sağlık Enstitüleri (Grant Number RO1CA177984) ulusal kanser enstitüsü tarafından yazarların laboratuvarına finansman desteği de kabul edilmektedir. Rajvir Dahiya, BX004473 Gazi İşleri Bölümü’nde Kıdemli Araştırma Kariyer BilimCisi dir ve NIH-UO1199694 (RD) tarafından finanse edilmektedir. Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarın görüşleridir ve Mutlaka Savunma Bakanlığı veya ABD Ordusu tarafından onaylanmaz. Biz Judy Shigenaga, San Francisco VAMC de çekirdek tesis müdürü, NextSeq 500 sequencer ile ona yardım için müteşekkiriz.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
Riferimenti
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Ricerca sul cancro. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Ricerca sul cancro. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
