In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane
Summary
Ce protocole décrit l’isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l’application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.
Abstract
Plusieurs protocoles ont été rapportés dans la littérature pour l’isolement et la culture des cellules épithéliales amniotiques humaines (HAEC). Cependant, ceux-ci supposent que l’épithélium amniotique est une couche homogène. L’amnion humain peut être divisé en trois régions anatomiques : réfléchie, placentaire et ombilicale. Chaque région a des rôles physiologiques différents, tels que dans des conditions pathologiques. Ici, nous décrivons un protocole pour disséquer le tissu humain d’amnion dans trois sections et le maintenir in vitro. Dans la culture, les cellules dérivées de l’amnion réfléchi ont montré une morphologie cuboïde, alors que les cellules des régions placentaires et ombilicales étaient squamous. Néanmoins, toutes les cellules obtenues ont un phénotype épithélial, démontré par l’immunodétection de l’E-cadherin. Ainsi, étant donné que les régions placentales et réfléchies in situ diffèrent dans les composants cellulaires et les fonctions moléculaires, il peut être nécessaire que les études in vitro tiennent compte de ces différences, car elles pourraient avoir des implications physiologiques pour l’utilisation de l’AOHC dans biomédecine et l’application prometteuse de ces cellules en médecine régénérative.
Introduction
Les cellules d’épithélium amniotique humaine (HAEC) proviennent des premiers stades du développement embryonnaire, à environ huit jours de postfertilisation. Ils proviennent d’une population de cellules épithéliales squameuses de l’épiblaste qui dérivent de la couche la plus interne de la membrane amniotique1. Ainsi, HAEC sont considérés comme des restes de cellules pluripotentes de l’épiblaste qui ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales de l’embryon2. Au cours de la dernière décennie, divers groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour isoler ces cellules de la membrane amniotique à la période de gestation afin de caractériser leurs propriétés présomptives liées à la pluripotence dans un modèle culturel in vitro3,4.
En conséquence, il a été constaté que HAEC caractéristiques caractéristiques des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC), tels que les antigènes de surface SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; le noyau des facteurs de transcription de pluripotence OCT4, SOX2, et NANOG ; et le marqueur de prolifération KI67, suggérant qu’ils sont auto-renouvellement5,6,7. En outre, ces cellules ont été contestées en utilisant des protocoles de différenciation pour obtenir des cellules positives pour les marqueurs spécifiques à la lignée des trois couches germinales (ectoderm, mesoderm et endoderm)4,5,8, ainsi que dans les modèles animaux des maladies humaines. Enfin, HAEC exprime E-cadherin, qui démontrent qu’ils conservent une nature épithéliale un peu comme le HPSC5,9.
En dehors de leur origine embryonnaire, HAEC ont d’autres propriétés intrinsèques qui les rendent adaptés à différentes applications cliniques, telles que la sécrétion de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes10,11, facteurs de croissance et la libération de cytokine12, aucune formation de tératomes quand ils sont transplantés dans des souris immunodéficientes en contraste avec HPSC2, et la tolérance immunologique parce qu’ils expriment HLA-G, qui diminue le risque de rejet après transplantation13.
Cependant, les rapports précédents ont supposé que l’amnion humain est une membrane homogène, sans considérer qu’il peut être anatomiquement et physiologiquement divisé en trois régions : placentaire (l’amnion qui couvre le basalis de cidua),ombilical (la partie qui enveloppe le cordon ombilical), et réfléchi (le reste de la membrane non attachée au placenta)14. Il a été démontré que les régions placentales et réfléchies de l’amnion présentent des différences dans la morphologie, l’activité mitochondriale, la détection des espèces réactives d’oxygène15, l’expression miRNA16, et l’activation des voies de signalisation17. Ces résultats suggèrent que l’amnion humain est intégré par une population hétérogène avec des fonctionnalités différentes qui devraient être considérées pour d’autres études menées dans des modèles in situ ou in vitro. Alors que d’autres laboratoires ont conçu des protocoles pour l’isolement de HAEC de toute la membrane, notre laboratoire a établi un protocole pour isoler, culturer et caractériser les cellules de différentes régions anatomiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons mis en œuvre un nouveau protocole pour isoler HAEC des membranes à terme. Il diffère des rapports précédents en ce que chaque membrane a été divisée en ses trois régions anatomiques avant l’isolement pour analyser des cellules de chacun.
Une des étapes les plus critiques dans le protocole est le lavage de la membrane pour enlever tous les caillots sanguins, car ils peuvent interférer avec l’activité de la trypsine lors de la séparation des cellules épithéliales. Le d?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos recherches ont été soutenues par des subventions de l’Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 et 21081) et du CONACYT (A1-S-8450 et 252756). Nous remercions Jessica Gonzalez Norris et Lidia Yuriria Paredes Vivas pour le soutien technique.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
Riferimenti
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