인간 양막의 다른 해부학 적 영역에서 상피 세포의 시험관 내 배양
Summary
이 프로토콜은 임상 및 생리병리학 적 모델에서 가능한 적용을위한 그들의 이질성 및 기능적 특성을 결정하기 위해 인간 양막의 상이한 해부학 적 영역에서 상피 세포의 분리를 설명합니다.
Abstract
몇몇 프로토콜은 인간 양수 상피 세포의 분리 및 배양에 대한 문헌에서 보고되었다(HAEC). 그러나, 이들은 양상상피가 균질한 층이라고 가정합니다. 인간 양막은 반사, 태반 및 배꼽의 세 가지 해부학 영역으로 나눌 수 있습니다. 각 지역은 병리학 적 조건에서와 같은 다른 생리적 역할을 가지고 있습니다. 여기서, 우리는 3개의 단면도에서 인간 양수 조직을 해부하고 시험관내에서 유지하는 프로토콜을 기술한다. 배양에서, 반사된 양막에서 유래된 세포는 입방체 형태를 나타내었고, 태반 및 배꼽 영역 모두에서 세포는 편평상피였다. 그럼에도 불구하고, 수득된 모든 세포는 상피 표현형을 가지며, E-카데린의 면역 검출에 의해 입증되었다. 따라서, 자리에서 태반 및 반사 된 영역은 세포 구성 요소와 분자 기능이 다르기 때문에, HAEC의 사용에 대한 생리적 영향을 가질 수 있기 때문에 시험관 내 연구에서 이러한 차이를 고려해야 할 수도 있습니다. 생물 의학 연구 및 재생 의학에서 이러한 세포의 유망한 응용 프로그램.
Introduction
인간 양수 상피 세포 (HAEC)는 배아 발달의 초기 단계 동안, 약 8 일 후 추론에서 발생합니다. 그들은 양막1의가장 안쪽 층에서 파생되는 상피 세포의 편평상피 세포 집단에서 발생합니다. 따라서, HAEC는 배아2의3개의 생식층으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 에피블라스트로부터 다능성 세포의 잔재로 간주된다. 지난 10년간, 다양한 연구그룹은 임신 기간 동안 양막으로부터 이들 세포를 분리하는 방법을 개발하여 시험관 내 배양 모델에서 그들의 추정 다능성 관련 특성을 특성화하였다3,4.
따라서, HAEC는 표면 항원 SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81과 같은 인간 다능성 줄기 세포(HPSC)의 특성특성이 있음을 알 수 있다; 다능 전사 인자 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 핵심; 및 증식 마커 KI67, 그들은 자기 갱신 제안5,6,7. 더욱이, 이들 세포는 인간 질병의 동물 모델뿐만 아니라 3개의 생식층(ectoderm, mesoderm, 및내배엽)의계보 특이적 마커에 대해 양성 세포를 얻기 위해 분화 프로토콜을 사용하여 도전해 왔다. 마지막으로, HAEC는 HPSC5,9와같은 상피 성질을 유지한다는 것을 입증하는 E-cadherin을 표현합니다.
그들의 배아 기원 에서, HAEC는 항염증 및 항균 분자의분비10,11,성장 인자 및 사이토카인 방출12,면역 결핍 마우스로 이식될 때 기형종의 형성이 없고, HPSC2와대조적으로 면역 결핍 마우스로 이식될 때, 그리고 HLA 를 발현하기 때문에 면역 학적 내성, 그리고 면역 학적 내성을 표현하기 때문에 면역 학적 내성, 및 면역 학적 내성과 같은 다른 임상 응용 프로그램에 적합하게하는 다른 본질적 특성을 가지고 있습니다. 이식13.
그러나, 이전 보고는 인간 양막이 해부학적으로 생리적으로 세 가지 영역으로 나눌 수 있다는 것을 고려하지 않고 균질한 막이라고 가정했습니다: 태반 (데시두아 기저를덮는 양막), 탯줄 (탯줄을 감싸는 부분), 및 반영 (태반에 부착되지 않은 막의 나머지 부분)14. 양수의 태반 및 반사 부위는 형태, 미토콘드리아 활성, 반응성 산소 종15의검출, miRNA 발현16,및 신호 경로(17)의 활성화에서 차이를 나타낸다. 이 결과는 인간 양박이 상이체 또는 시험관 내 모델에서 수행된 추가 연구를 위해 고려되어야 하는 다른 기능을 가진 이기종 인구에 의해 통합된다는 것을 건의합니다. 다른 실험실은 전체 막에서 HAEC의 격리를 위한 프로토콜을 설계하는 동안, 우리의 실험실은 다른 해부학 적인 지구에서 세포를 격리하고, 배양하고, 특성화하는 프로토콜을 설치했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 용어 막에서 HAEC를 격리하는 새로운 프로토콜을 구현했습니다. 각 막은 각 세포에서 세포를 분석하기 위해 격리되기 전에 세 가지 해부학 영역으로 분할되었다는 점에서 이전 보고서와 다릅니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 상피 세포를 분리 할 때 트립신의 활성을 방해 할 수 있기 때문에 모든 혈전을 제거하는 멤브레인의 세척입니다. 이 단계를 제대?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리의 연구는 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아 데 멕시코 (21041 및 21081) 및 CONACYT (A1-S-8450 및 252756)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 기술 지원을 위해 제시카 곤잘레스 노리스와 리디아 유리리아 파레데스 비바스에게 감사드립니다.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
Riferimenti
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