In vitro-kultur af Epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den humane amniotiske membran
Summary
Denne protokol beskriver isolationen af epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den menneskelige amniotiske membran til at bestemme deres heterogenitet og funktionelle egenskaber for mulige anvendelse i kliniske og fysiopatologiske modeller.
Abstract
Flere protokoller er blevet rapporteret i litteraturen for isolation og kultur af humane amniotiske epiteliale celler (HAEC). Men, disse antager, at Foster epitelet er et homogent lag. Den menneskelige amnion kan opdeles i tre anatomiske regioner: reflekteret, placenta og navle. Hver region har forskellige fysiologiske roller, såsom i patologiske tilstande. Her beskriver vi en protokol til dissekere humant amnion væv i tre sektioner og vedligeholde det in vitro. I kulturen viste celler afledt af den reflekterede amnion en cuboidal morfologi, mens celler fra både placenta og navle lige regioner var skællede. Ikke desto mindre, alle de opnåede celler har en epitelial fænotype, demonstreret ved immunodetektion af E-cadherin. Da placenta og reflekterede regioner in situ adskiller sig fra hinanden i celle komponenter og molekylære funktioner, kan det derfor være nødvendigt for in vitro-undersøgelser at tage hensyn til disse forskelle, fordi de kan have fysiologiske konsekvenser for brugen af HAEC i biomedicinsk forskning og den lovende anvendelse af disse celler i regenerativ medicin.
Introduction
Humane amniotiske epitelceller (haec) har oprindelse i de tidlige stadier af fosterudviklingen, på omkring otte dage efter befrugtning. De opstår fra en population af plade epiteliale celler i epiblast, der stammer fra det inderste lag af den amniotiske membran1. Således betragtes HAEC som rester af pluripotente celler fra epiblast, der har potentialet til at differentiere sig til de tre kimlag i embryonet2. I de sidste ti år har forskellige forskergrupper udviklet metoder til at isolere disse celler fra Foster membranen ved drænings perioden for at karakterisere deres formodede pluripotrelaterede egenskaber i en kulturmodel in vitro3,4.
Det er derfor blevet konstateret, at HAEC har egenskaber, der er karakteristiske for humane pluripotente stamceller (HPSC), såsom overfladeantigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kernen i pluripotens transkriptionsfaktorer OCT4, SOX2 og NANOG; og spredning markør KI67, tyder på, at de er selvfornyende5,6,7. Desuden er disse celler blevet udfordret ved hjælp af differentierings protokoller for at opnå celler positive for Lineage-specifikke markører for de tre kimlag (ectoderm, mesoderm, og endoderm)4,5,8, samt i dyremodeller af sygdomme hos mennesker. Endelig haec Express E-cadherin, som viser, at de bevarer en epitelial natur meget gerne hpsc5,9.
Ud over deres embryonale oprindelse har haec andre iboende egenskaber, der gør dem velegnede til forskellige kliniske anvendelser, såsom udskillelsen af antiinflammatoriske og antibakterielle molekyler10,11, vækstfaktorer og cytokinfrigivelse12, ingen dannelse af Teratomer, når de transplanteres til immunodedygtige mus i modsætning til hpsc2, og immunologisk tolerance, fordi de udtrykker HLA-G, hvilket nedsætter risikoen for afvisning efter transplantation13.
Tidligere rapporter har imidlertid antaget, at den humane amnion er en homogen membran, uden at overveje, at det kan være anatomisk og fysiologisk opdelt i tre regioner: placenta (den amnion, der dækker lærk basalis), navlestrengen (den del, der indhyller navlestrengen), og reflekteres (resten af membranen ikke er fastgjort til placenta)14. Det har vist sig, at de placentale og reflekterede områder af amnion viser forskelle i morfologi, mitokondriel aktivitet, påvisning af reaktive ilt arter15, Mirna udtryk16, og aktivering af signalering veje17. Disse resultater tyder på, at den menneskelige amnion er integreret af en heterogen population med forskellig funktionalitet, der bør overvejes for yderligere undersøgelser udført i enten in situ-eller in vitro-modeller. Mens andre laboratorier har designet protokoller til isolering af HAEC fra hele membranen, vores laboratorium har etableret en protokol til at isolere, kultur, og karakterisere celler fra forskellige anatomiske regioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har implementeret en ny protokol for at isolere HAEC fra term membraner. Det adskiller sig fra tidligere rapporter i, at hver membran var opdelt i sine tre anatomiske regioner forud for isolation til at analysere celler fra hver enkelt.
En af de mest kritiske trin i protokollen er vask af membranen til at fjerne alle blodpropper, fordi de kan forstyrre aktiviteten af trypsin, når adskille epiteliale celler. Undladelse af at udføre dette trin ordentligt kan føre til opnåelse af en primæ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vores forskning blev støttet af tilskud fra Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 og 21081) og CONACYT (a1-S-8450 og 252756). Vi takker Jessica González Norris og Lidia Yuriria Paredes Vivas for den tekniske støtte.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
Riferimenti
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
