Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten
Summary
Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.
Abstract
Transfection is een technisch proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in cellen worden geleverd om het gen van belang te wijzigen. Momenteel wordt transgene technologie een onmisbaar instrument voor de studie van Eimeria, de veroorzakers van coccidiose bij pluimvee en vee. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van stabiele transfection bij eimerian parasieten: zuivering en nucleofection van sporozoiten of tweede generatie merozoiten, en in vivo voortplanting van transfected parasieten. Met behulp van dit protocol bereikten we transfection in verschillende soorten Eimeria. Samen is nucleofection een nuttig hulpmiddel om genetische manipulatie bij eimerian parasieten te vergemakkelijken.
Introduction
Eimeria spp. veroorzaakt coccidiose, wat leidt tot aanzienlijke economische verliezen in de vee- en pluimveesector. Hoewel anticoccidiale geneesmiddelen, en tot op zekere hoogte, verzwakte antikokkendievaccins, op grote schaal zijn gebruikt voor de bestrijding van coccidiose, zijn er nog steeds tekortkomingen met betrekking tot hun resistentie tegen geneesmiddelen, medicijnresiduen en de potentiële verspreiding van vaccinstammen die virulentie herwinnen1. Met de ontwikkeling van moleculaire biologie is transfection een essentieel instrument geworden voor het bestuderen van genfuncties, het ontwikkelen van nieuwe vaccins en het screenen van nieuwe medicijndoelen voor Eimeria.
In de afgelopen decennia is transfection met succes toegepast voor apicomplexan parasieten zoals Plasmodium en Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Een studie met β-gal als verslaggever voor de transfection in E. tenella loodste dergelijk werk in Eimeria7. De transfection van E. tenella8,9, E. mitis10, en E. acervulina (Zhang et al., ongepubliceerde gegevens) was succesvol bij kippen. Onlangs bereikten we transfection met behulp van merozoites van E. necatrix door nucleofection11.
Studies toonden aan dat Eimeria die een heterologantigeen uitdrukt, het potentieel heeft om te worden ontwikkeld als een recombinant vaccin, zoals die waarin Campylobacter jejuni-antigeen A (CjaA) of kippeninterleukine 2 (chIL-2)12,13uitdrukt . Daarom beschrijft dit protocol een nucleofection studie van Eimeria spp. bij kippen. De procedure beschrijft zuivering van sporozoiten of merozoïeten, nucleofection met plasmid DNA, cloacale inenting/intraveneuze injectie en in vivo voortplanting om onderzoekers te helpen bij het starten van studies over transgene Eimeria-parasieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de jaren 1990 werd een transfection systeem ontwikkeld voor apicomplexan parasieten, en het werd gebruikt voor studies over eimerian parasieten. Onlangs werd staltransfection uitgevoerd in E. tenella8,9 en E. nieschulzi15. We bereikten de stabiele transfection van E. necatrix door transfecting tweede generatie merozoites11. Inenting van transfected sporozoites van E. acervulina…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2017YFD0501200) en de National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 en 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
Riferimenti
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
