Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten
Summary
Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.
Abstract
Transfektion ist ein technischer Prozess, durch den genetisches Material, wie DNA und doppelsträngige RNA, in Zellen abgegeben werden, um das Gen von Interesse zu modifizieren. Derzeit wird die transgene Technologie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von Eimeria, den Erregern der Kokzidiose bei Geflügel und Vieh. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der stabilen Transfektion bei eimerischen Parasiten: Reinigung und Nukleofektion von Sporozoiten oder Merozoiten der zweiten Generation und in vivo Vermehrung transfizierter Parasiten. Mit diesem Protokoll erreichten wir die Transfektion bei mehreren Eimeria-Arten. Zusammengenommen ist die Nukleofektion ein nützliches Werkzeug, um genetische Manipulationen bei eimerischen Parasiten zu erleichtern.
Introduction
Eimeria spp. verursacht Kokziidiose, was zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Vieh- und Geflügelindustrie führt. Obwohl Antikokiside und in gewissem Maße abgeschwächte Antikokzien-Impfstoffe häufig zur Bekämpfung der Kokzidizien-Impfung eingesetzt wurden, gibt es immer noch Mängel in Bezug auf ihre Arzneimittelresistenz, Arzneimittelrückstände und die mögliche Diffusion von Impfstoffstämmen, die virulenz zurückgewinnen1. Mit der Entwicklung der Molekularbiologie ist die Transfektion zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Genfunktionen zu untersuchen, neuartige Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeriazu screening.
In den letzten Jahrzehnten wurde die Transfektion erfolgreich für apicomplexan Parasiten wie Plasmodium und Toxoplasma gondii2,3,4,5,6angewendet. Eine Studie, in der die Transfektion in E. tenella als Reporter für die Transfektion verwendet wurde, führte in Eimeria7auf solche Arbeiten. Die Transfektion von E. tenella8,9, E. mitis10und E. acervulina (Zhang et al., unveröffentlichte Daten) war bei Hühnern erfolgreich. Kürzlich erreichten wir die Transfektion mit Merozoiten von E. necatrix durch Nukleofection11.
Studien zeigten, dass Eimeria, die ein heterologes Antigen exizipieren, das Potenzial hat, als rekombinanter Impfstoff entwickelt zu werden, wie z. B. solche, die Campylobacter Jejuni-Antigen A (CjaA) oder Huhn interleukin 2 (chIL-2)12,13. Daher beschreibt dieses Protokoll eine Nukleofektionsstudie von Eimeria spp. bei Hühnern. Das Verfahren beschreibt die Reinigung von Sporozoiten oder Merozoiten, Die Nukleofektion mit Plasmid-DNA, die cloakale Inokulation/intravenöse Injektion und die In-vivo-Vermehrung, um Forschern zu helfen, Studien über transgene Eimeria-Parasiten zu beginnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den 1990er Jahren wurde ein Transfektionssystem für apicomplexan Parasiten entwickelt, und es wurde für Studien über eimerische Parasiten verwendet. Kürzlich wurde eine stabile Transfektion in E. tenella8,9 und E. nieschulzi15durchgeführt. Wir erreichten die stabile Transfektion von E. necatrix durch transfizierende Merozoiten der zweiten Generation11. Die Impfung der transfizierte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) und der National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 und 31873007) unterstützt.
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
Riferimenti
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
