Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.
Transfection is een technisch proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in cellen worden geleverd om het gen van belang te wijzigen. Momenteel wordt transgene technologie een onmisbaar instrument voor de studie van Eimeria, de veroorzakers van coccidiose bij pluimvee en vee. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van stabiele transfection bij eimerian parasieten: zuivering en nucleofection van sporozoiten of tweede generatie merozoiten, en in vivo voortplanting van transfected parasieten. Met behulp van dit protocol bereikten we transfection in verschillende soorten Eimeria. Samen is nucleofection een nuttig hulpmiddel om genetische manipulatie bij eimerian parasieten te vergemakkelijken.
Eimeria spp. veroorzaakt coccidiose, wat leidt tot aanzienlijke economische verliezen in de vee- en pluimveesector. Hoewel anticoccidiale geneesmiddelen, en tot op zekere hoogte, verzwakte antikokkendievaccins, op grote schaal zijn gebruikt voor de bestrijding van coccidiose, zijn er nog steeds tekortkomingen met betrekking tot hun resistentie tegen geneesmiddelen, medicijnresiduen en de potentiële verspreiding van vaccinstammen die virulentie herwinnen1. Met de ontwikkeling van moleculaire biologie is transfection een essentieel instrument geworden voor het bestuderen van genfuncties, het ontwikkelen van nieuwe vaccins en het screenen van nieuwe medicijndoelen voor Eimeria.
In de afgelopen decennia is transfection met succes toegepast voor apicomplexan parasieten zoals Plasmodium en Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Een studie met β-gal als verslaggever voor de transfection in E. tenella loodste dergelijk werk in Eimeria7. De transfection van E. tenella8,9, E. mitis10, en E. acervulina (Zhang et al., ongepubliceerde gegevens) was succesvol bij kippen. Onlangs bereikten we transfection met behulp van merozoites van E. necatrix door nucleofection11.
Studies toonden aan dat Eimeria die een heterologantigeen uitdrukt, het potentieel heeft om te worden ontwikkeld als een recombinant vaccin, zoals die waarin Campylobacter jejuni-antigeen A (CjaA) of kippeninterleukine 2 (chIL-2)12,13uitdrukt . Daarom beschrijft dit protocol een nucleofection studie van Eimeria spp. bij kippen. De procedure beschrijft zuivering van sporozoiten of merozoïeten, nucleofection met plasmid DNA, cloacale inenting/intraveneuze injectie en in vivo voortplanting om onderzoekers te helpen bij het starten van studies over transgene Eimeria-parasieten.
In de jaren 1990 werd een transfection systeem ontwikkeld voor apicomplexan parasieten, en het werd gebruikt voor studies over eimerian parasieten. Onlangs werd staltransfection uitgevoerd in E. tenella8,9 en E. nieschulzi15. We bereikten de stabiele transfection van E. necatrix door transfecting tweede generatie merozoites11. Inenting van transfected sporozoites van E. acervulina…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2017YFD0501200) en de National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 en 31873007).
ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
DMEM | MACGENE | CM15019 | |
Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
Glucose | Sigma | No. V900116 | |
Glycine | Biotopped | G6200 | |
HBSS | MACGENE | CC016 | |
KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
MgCl2 | Sigma | 449164 | |
MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
PBS | Solarbio | P1010 | |
Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
Trypsin | Solarbio | T8150 | |
Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |