न्यूक्लीफेक्शन और चिकन इमेरिया परजीवी के वीवो प्रचार में
Summary
यहां, हमने न्यूक्लीफेकेटिंग स्पोरोज़ोइट्स या दूसरी पीढ़ी के मेरोजोइट्स द्वारा चिकन इमेरिया परजीवी के स्थिर ट्रांसफेक्शन को प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रदान की। विषमलोगोस एंटीजेनिक जीन व्यक्त करने वाले आनुवंशिक रूप से संशोधित ईमेरियन परजीवी का उपयोग वैक्सीन डिलीवरी वाहनों के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
ट्रांसफेक्शन एक तकनीकी प्रक्रिया है जिसके माध्यम से आनुवंशिक सामग्री, जैसे डीएनए और डबल-फंसे आरएनए, ब्याज के जीन को संशोधित करने के लिए कोशिकाओं में वितरित किए जाते हैं। वर्तमान में, ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी Eimeria,पोल्ट्री और पशुधन में coccidiosis के कारक एजेंटों के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनता जा रहा है । यह प्रोटोकॉल ईमेरियन परजीवी में स्थिर ट्रांसफेक्शन का विस्तृत विवरण प्रदान करता है: स्पूरोजोइट्स या दूसरी पीढ़ी के मेरोजोइट्स की शुद्धि और न्यूक्लियोफेक्शन, और ट्रांससंक्रमित परजीवी के वीवो प्रचार में। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने ईमेरियाकी कई प्रजातियों में ट्रांसफेक्शन हासिल किया। एक साथ लिया गया, न्यूक्लियोफेक्शन ईमेरियन परजीवी में आनुवंशिक हेरफेर को सुविधाजनक बनाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Introduction
Eimeria spp. coccidiosis का कारण बनता है, जो पशुधन और पोल्ट्री उद्योग में पर्याप्त आर्थिक नुकसान की ओर जाता है । हालांकि एंटीकोसिडायल दवाएं, और एक हद तक, तनु एंटीकोसिडायल टीकों, कोसिडिओसिस के नियंत्रण के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, अभी भी उनकी दवा प्रतिरोध, दवा अवशेषों, और वैक्सीन उपभेदों के संभावित प्रसार के बारे में कमियां हैं जो उग्रता1हासिल करते हैं। आणविक जीव विज्ञान के विकास के साथ, ट्रांसफेक्शन जीन कार्यों का अध्ययन करने, उपन्यास टीकों के विकास और Eimeriaके लिए नई दवा लक्ष्यों की स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है ।
पिछले दशकों में, प्लाज्मोडियम और टॉक्सोप्लास्मा गोंडी2,3,4,5,6जैसे एपीकॉम्प्लेक्सन परजीवी के लिए ट्रांसफेक्शन सफलतापूर्वक लागू किया गया है। ई. Tenella में ट्रांसफेक्शन के लिए एक रिपोर्टर के रूप में एक लड़की का उपयोग कर एक अध्ययन Eimeria7में इस तरह के काम का संचालन किया । ई. टेनेला8,9, ई मिटिस10,और ई. एसरवुलिना (झांग एट अल., अप्रकाशित डेटा) का ट्रांसफेक्शन मुर्गियों में सफल रहा । हाल ही में, हमने न्यूक्लियोफेक्शन11के माध्यम से ई. नेकेट्रिक्स के मेरोज़ोइट्स का उपयोग करके ट्रांसफेक्शन हासिल किया।
अध्ययनों से पता चला है कि एक विषमजीवस एंटीजन व्यक्त करने वाले ईमेरिया में एक पुनर्संयोजन टीका के रूप में विकसित करने की क्षमता है, जैसे कि कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी एंटीजन ए (CjaA) या चिकन इंटरल्यूकिन 2 (CHIL-2)12,13को व्यक्त करना। इसलिए, यह प्रोटोकॉल मुर्गियों में Eimeria spp के एक नाभिक अध्ययन का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया स्पॉरोज़ोइट्स या मेरोजोइट्स की शुद्धि, प्लाज्मिड डीएनए के साथ न्यूक्लियोफेक्शन, क्लोकल इनोक्रेशर/नसों में इंजेक्शन और वीवो प्रचार में शोधकर्ताओं को ट्रांसजेनिक इमेरिया परजीवी पर अध्ययन शुरू करने में मदद करने के लिए वर्णित करती है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
1 99 0 के दशक में, एपीकॉम्प्लेक्सन परजीवी के लिए एक ट्रांसफेक्शन सिस्टम विकसित किया गया था, और इसका उपयोग ईमेरियन परजीवी पर अध्ययन के लिए किया गया था। हाल ही में, ई. टेनेला8,9 और ई. न?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFD0501200) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31572507, 31772728 और 31873007) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
Riferimenti
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
