Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango
Summary
Aqui, fornecemos um método para alcançar a transfecção estável de parasitas de frango Eimeria por nucleofecting esporozoitas ou merozoitas de segunda geração. Parasitas eimerianos geneticamente modificados expressando genes antigênicos heterologous poderiam ser usados como veículos de entrega de vacinas.
Abstract
Transfecção é um processo técnico através do qual material genético, como DNA e RNA de dupla cadeia, são entregues em células para modificar o gene de interesse. Atualmente, a tecnologia transgênica está se tornando uma ferramenta indispensável para o estudo da Eimeria, os agentes causadores da coccidiose em aves e pecuária. Este protocolo fornece uma descrição detalhada da transfecção estável em parasitas eimerianos: purificação e nucleofeção de esporozoitas ou merozoitas de segunda geração, e propagação in vivo de parasitas transfeccionados. Usando este protocolo, conseguimos transfecção em várias espécies de Eimeria. Juntas, a nucleofection é uma ferramenta útil para facilitar a manipulação genética em parasitas eimerianos.
Introduction
Eimeria spp. causa coccidiose, o que leva a perdas econômicas substanciais na pecuária e na indústria avícola. Embora os medicamentos anticoccidial, e até certo ponto, atenuados vacinas anticoccidial, tenham sido amplamente utilizados para o controle da coccidiose, ainda há deficiências em relação à sua resistência a medicamentos, resíduos de drogas e a potencial difusão de cepas de vacinas que recuperam a virulência1. Com o desenvolvimento da biologia molecular, a transfecção tornou-se uma ferramenta vital para estudar funções genéticas, desenvolver novas vacinas e triagem de novos alvos medicamentosos para Eimeria.
Nas últimas décadas, a transfecção foi aplicada com sucesso para parasitas apicomplexos como Plasmodium e Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Um estudo usando β-gal como repórter para a transfecção em E. tenella pilotou tal trabalho na Eimeria7. A transfecção de E. tenella8,9, E. mitis10, e E. acervulina (Zhang et al., dados inéditos) foi bem sucedida em galinhas. Recentemente, conseguimos transfecção usando merozoitas de E. necatrix através da nucleofection11.
Estudos mostraram que a Eimeria expressando um antígeno heterologous tem potencial para ser desenvolvida como uma vacina recombinante, como as expressas que expressam o antígeno Campylobacter jejuni A (CjaA) ou interleucina de frango 2 (chIL-2)12,13. Portanto, este protocolo descreve um estudo de nucleofection de Eimeria spp. em galinhas. O procedimento descreve a purificação de esporozoitas ou merozoitas, nucleofection com DNA plasmídeo, inoculação cloacal/injeção intravenosa e propagação in vivo para ajudar pesquisadores a iniciar estudos sobre parasitas transgênicos da Eimeria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na década de 1990, foi desenvolvido um sistema de transfecção para parasitas apicomplexos, e foi usado para estudos em parasitas eimerianos. Recentemente, a transfecção estável foi realizada em E. tenella8,9 e E. nieschulzi15. Alcançamos a transfecção estável de E. necatrix transfecting merozoites de segunda geração11. A inoculação de esporozoitas transfeccionadas de E. a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2017YFD0501200) e pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31572507, 31772728 e 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
Riferimenti
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