यहां प्रस्तुत डिसेक्शन और लिपिड बूंद के लिए विस्तृत तरीके हैं ड्रोसोफिला लार्वा में ओएनोसाइट्स के बोडिप्पी 493/503 का उपयोग करके, एक लिपिड ड्रॉपलेट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाया।
लिपिड पशु विकास और शारीरिक होमोस्टोसिस के लिए आवश्यक हैं। लिपिड मेटाबोलिज्म के डिस्रेगुलेशन के परिणामस्वरूप मोटापा और फैटी लिवर जैसे विभिन्न विकासात्मक दोष और बीमारियां होती हैं। आमतौर पर लिपिड की बूंदों में संग्रहीत किया जाता है, जो कोशिकाओं में बहुआयामी लिपिड स्टोरेज ऑर्गेनेल्स होते हैं। लिपिड की बूंदें विभिन्न ऊतकों में और विभिन्न परिस्थितियों में आकार और संख्या में भिन्न होती हैं। यह बताया गया है कि लिपिड बूंदों को इसके बायोजेनेसिस और क्षरण के नियमन के माध्यम से कसकर नियंत्रित किया जाता है । ड्रोसोफिला मेलानोगास्टरमें, ओनोसाइट लिपिड मेटाबोलिज्म के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतक है और हाल ही में तनाव के जवाब में लिपिड जुड़ाव के बारे में एक मानव यकृत एनालॉग के रूप में पहचाना गया है। हालांकि, ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट मेटाबोलिज्म के नियमन में अंतर्निहित तंत्र मायावी बने हुए हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, विकास के दौरान और तनावपूर्ण परिस्थितियों में ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट गतिशील परिवर्तनों की सीधी कल्पना करने के लिए एक विश्वसनीय और संवेदनशील विधि विकसित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। लिपोफिलिक बॉडीपी 493/503 का लाभ उठाते हुए, एक लिपिड बूंद-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंग, यहां वर्णित है, भुखमरी के जवाब में ड्रोसोफिला लार्वा के ओनोसाइट्स में विच्छेदन और बाद में लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विभिन्न परिस्थितियों में लिपिड ड्रॉपलेट गतिशीलता के गुणात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तेजी से और अत्यधिक प्रजनन विधि का उपयोग आनुवंशिक स्क्रीन में भी किया जा सकता है जिसमें ओनोसाइट्स और अन्य ऊतकों में लिपिड ड्रॉपलेट मेटाबोलिज्म शामिल है।
लिपिड सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। सेलुलर झिल्ली प्रणालियों के अभिन्न घटकों के रूप में उनकी पारंपरिक भूमिका के अलावा, लिपिड भी ऊर्जा की आपूर्ति में महत्वपूर्ण कार्य खेलते हैं और व्यक्तिगत जानवरों के जीवन चक्र में ट्रांसड्यूक्शन का संकेत देते हैं1। इस प्रकार, लिपिड चयापचय कोशिकाओं में शारीरिक हेमोस्सिस बनाए रखने के लिए सख्त नियमों के अनुरूप होना चाहिए। ज्ञात हो कि लिपिड मेटाबोलिज्म के डिस्रेगुलेशन के परिणामस्वरूप मधुमेह और फैटी लिवर जैसी विभिन्न बीमारियां होती हैं। पशु स्वास्थ्य में लिपिड चयापचय के बहुत महत्व के बावजूद, लिपिड चयापचय विनियमन अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं ।
ड्रोसोफिला बड़े पैमाने पर वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है के बाद से प्रोफेसर थॉमस एच मॉर्गन उंहें आनुवंशिकी और अंय बुनियादी जैविकसवालों सेजुड़े अध्ययन में उपयोग शुरू कर दिया 2 । पिछले कुछ दशकों में, उभरते सबूतों से पता चला है कि ड्रोसोफिला मोटापा1,3जैसे कई लिपिड मेटाबोलिज्म से जुड़े रोगों के अध्ययन में एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है । विशेष रूप से, ड्रोसोफिला मनुष्यों के साथ अत्यधिक संरक्षित मेटाबोलिक जीन साझा करता है और लिपिड मेटाबोलिज्म के लिए समान प्रासंगिक ऊतकों/अंगों और कोशिका प्रकारों के अधिकारी हैं ।
उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिलाका वसा शरीर, जो ट्राइसिलग्लिसराइड स्टोरेज के लिए जिम्मेदार है, मानव एडीपोस ऊतक के अनुरूप कार्य करता है। हाल ही में, विशेष हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं (यानी, ओनोसाइट्स) का एक समूह, जिसे मानव यकृत के लिए एक कार्यात्मक एनालॉग बताया गया है, को फल मक्खियोंमेंफैटी एसिड और हाइड्रोकार्बन मेटाबोलिज्म में शामिल दिखाया गया है4,5। स्तनपायी यकृत में मामले के समान, ओनोसाइट्स लार्वा और वयस्क ड्रोसोफिलादोनों में लिपिड बूंद गठन को सक्रिय करके भुखमरी का जवाब देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ओनोसाइट्स4,6,7,8में लिपिड बूंद संचय होता है। शारीरिक रूप से, ओनोसाइट्स को पेट के हेमिसेगमेंट प्रति लगभग छह कोशिकाओं के समूहों में पार्श्व एपिडर्मिस की बेसल आंतरिक सतह से कसकर जुड़ा हुआ है, जो एपिडरमिस से ओनोसाइट समूहों को अलग करना अव्यवहारिक बनाता है। इस प्रकार, ओनोसाइट्स को विच्छेदन और धुंधला के दौरान एपिडर्मिस से जोड़ा जाना चाहिए।
लिपिड लिपिड बूंदों के रूप में संग्रहीत होते हैं, जो कोशिकाओं9में एकल परत झिल्ली के साथ ऑर्गेनेल्स होते हैं। लिपिड की बूंदें विभिन्न प्रजातियों में लगभग सभी कोशिका प्रकारों में मौजूद हैं10। लिपिड ड्रॉपलेट गतिशीलता, इसके आकार और संख्या सहित, पर्यावरण ीय तनाव के जवाब में बदल जाते हैं। इसे तनाव के जवाब में मेटाबोलिक स्थिति का प्रतिबिंब माना जाता है, जैसे कि उम्र बढ़ने और भुखमरी7,8। इसलिए, विकास के दौरान और तनावपूर्ण परिस्थितियों में ओएनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट गतिशीलता को गुणात्मक रूप से निर्धारित करने के लिए एक व्यवहार्य और विश्वसनीय विधि विकसित करना बहुत महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, तीसरे इंस्टार लार्वा में, ओनोसाइट्स में खिलाया स्थितियों के तहत कुछ या कोई पता लगाने योग्य लिपिड बूंदें होती हैं, लेकिन उनमें पोषण अभाव4के बाद कई बड़ी लिपिड बूंदें होती हैं। इस विधि की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए, भूखे परिस्थितियों में ओनोसाइट्स में लिपिड बूंद धुंधला करने का सुझाव दिया जाता है।
वर्तमान में, कई लिपोफिलिक रंग लिपिड बूंदों के लिए उपलब्ध हैं, जैसे नॉनफ्लोरोसेंट रंग सूडान ब्लैक एंड ऑयल रेड ओ और फ्लोरोसेंट रंग नील लाल और बॉडीपी 493/50311। सूडान ब्लैक और ऑयल रेड ओ आमतौर पर ऊतक कोलेस्टेरिल एस्टर और ट्राइसिलग्लिसरोल के लिए उपयोग किए जाते हैं और हल्के माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है। हालांकि, अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि धुंधला और अपेक्षाकृत कम संकल्प लिपिड बूंद गतिशीलता के गुणात्मक विश्लेषण में अपने अनुप्रयोगों के लिए दो सीमित कारक हैं । नॉनफ्लोरोसेंट रंगों की सीमाओं को दूर करने के लिए, नील लाल और बॉडीपी 493/503 लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला के लिए आदर्श विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है । यह बताया गया है कि नील लाल कुछ अप्रतिम कोलेस्ट्रॉल का भी पता लगा सकता है, जो बोप्पी 493/503 को सेलुलर लिपिड बूंदों के लिए अधिक विशिष्ट रंग बनाता है, कुछ हद तक12,13,14।
सबसे बड़ी बात यह है कि ओनोसाइट्स में लिपिड बूंदों के तेजी से और संवेदनशील विश्लेषण की आवश्यकता को पूरा करने के लिए, यह प्रोटोकॉल दाग रंगे के रूप में बॉडीपी 493/503 का उपयोग करके स्थिर-आधारित लिपिड बूंद-विशिष्ट धुंधला की एक व्यवहार्य और अत्यधिक प्रजनन विधि प्रस्तुत करता है। इस रिपोर्ट में, ओनोसाइट्स विच्छेदित होते हैं, और बॉडीपी 493/503 का उपयोग ओनोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला करने के लिए किया जाता है, जिसमें लिपिड बूंदों का पता कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लगाया जाता है । इस प्रक्रिया की आसानी और सामर्थ्य इसे प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अन्य अनुप्रयोगों में संशोधन और आगे के उपयोग के लिए आदर्श बनाती है।
ऊपर उल्लिखित लोगों में से, इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, अंडा बिछाने की समय अवधि इनमें से एक होने के साथ । लिपिड जुटाने वाले ऊतक के रूप में, ओनोसाइट पोषण स्थिति6,8के प्रति अ…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671422, 31529004, और 31601112), 111 परियोजना (D18010), गुआंगडोंग पर्ल नदी प्रतिभा कार्यक्रम (2017BT01S155) की स्थानीय अभिनव और अनुसंधान टीमों परियोजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और चाइना पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (2018M640767) ।
50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
Agar | For fly food | ||
Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
Corn syrup | For fly food | ||
Cornmeal | For fly food | ||
Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
Dissection pin | N/A | N/A | |
Dissection plate | N/A | N/A | |
Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
Paintbrush | N/A | N/A | |
PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
Soy flour | For fly food | ||
Spatula | N/A | N/A | |
Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
Wipe paper | N/A | N/A | |
Yeast | For fly food | ||
yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |