Disección y tinción de gotas de lípidos de los ovenocitos en larvas de Drosophila
Summary
Aquí se presentan métodos detallados para la disección y la tinción de gotas lipídicas de los enocitos en larvas de Drosophila utilizando BODIPY 493/503, un tinte fluorescente específico de gotas de lípidos.
Abstract
Los lípidos son esenciales para el desarrollo animal y la homeostasis fisiológica. La desregulación del metabolismo lipídico da lugar a diversos defectos del desarrollo y enfermedades, como la obesidad y el hígado graso. Por lo general, los lípidos se almacenan en gotas de lípidos, que son los orgánulos multifuncionales de almacenamiento de lípidos en las células. Las gotas de lípidos varían en tamaño y número en diferentes tejidos y en diferentes condiciones. Se ha informado que las gotas de lípidos están estrechamente controladas a través de la regulación de su biogénesis y degradación. En Drosophila melanogaster, el enocito es un tejido importante para el metabolismo de los lípidos y se ha identificado recientemente como un análogo del hígado humano con respecto a la movilización de lípidos en respuesta al estrés. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la regulación del metabolismo de las gotas lipídicas en los enocitos siguen siendo esquivas. Para resolver este problema, es de suma importancia desarrollar un método fiable y sensible para visualizar directamente los cambios dinámicos de gotas lipídicas en los enocitos durante el desarrollo y en condiciones estresantes. Aprovechando el BODIPY 493/503 lipofílico, un tinte fluorescente específico de gotas lipídicas, descrito aquí es un protocolo detallado para la disección y posterior tinción de gotas lipídicas en los enocitos de larvas de Drosophila en respuesta a la inanición. Esto permite el análisis cualitativo de la dinámica de gotas lipídicas bajo diversas condiciones por microscopía confocal. Además, este método rápido y altamente reproducible también se puede utilizar en pantallas genéticas para identificar nuevos factores genéticos que implican el metabolismo de las gotas lipídicas en los enocitos y otros tejidos.
Introduction
Los lípidos son esenciales para la supervivencia celular. Además de su papel tradicional como componentes integrales de los sistemas de membrana celular, los lípidos también desempeñan funciones cruciales en el suministro de energía y la transducción de señalización a lo largo de los ciclos de vida de los animales individuales1. Por lo tanto, el metabolismo de los lípidos debe ajustarse a estrictas regulaciones para mantener la hemostasis fisiológica en las células. Se sabe que la desregulación del metabolismo lipídico resulta en varias enfermedades, como la diabetes y el hígado graso. A pesar de la gran importancia del metabolismo lipídico en la salud animal, los mecanismos subyacentes a la regulación del metabolismo lipídico siguen siendo en gran parte desconocidos.
Drosophila se ha utilizado ampliamente durante años desde que el profesor Thomas H. Morgan comenzó a utilizarlos en estudios relacionados con la genética y otras preguntas biológicas básicas2. En las últimas décadas, la evidencia emergente ha demostrado que la drosophila es un excelente organismo modelo en el estudio de muchas enfermedades asociadas al metabolismo lipídico, como la obesidad1,3. En particular, Drosophila comparte genes metabólicos altamente conservados con los seres humanos y poseen tejidos/órganos relevantes similares y tipos celulares para el metabolismo de los lípidos.
Por ejemplo, el cuerpo gordo de Drosophila,que es responsable del almacenamiento de triacilglicéridos, funciones análogas al tejido adiposo humano. Recientemente, se ha demostrado que un grupo de células especializadas similares a los hepatocitos (es decir, los enocitos), que se ha informado que son un análogo funcional al hígado humano, están implicados en el metabolismo de ácidos grasos e hidrocarburos en moscas de la fruta4,5. Al igual que en los hígados de mamíferos, los enocitos responden a la inanición activando la formación de gotas lipídicas tanto en Drosophilalarval como en adulta, lo que resulta en la acumulación de gotas lipídicas en los enocitos4,6,7,8. Anatómicamente, los enocitos están estrechamente unidos a la superficie interna basal de la epidermis lateral en grupos de aproximadamente seis células por hemisegmento abdominal, lo que hace que sea impracticable aislar los racimos de oenocitos de la epidermis. Por lo tanto, los enocitos deben estar unidos a la epidermis durante la disección y la tinción.
Los lípidos se almacenan en forma de gotas de lípidos, que son orgánulos con membranas de una sola capa en las células9. Las gotas de lípidos existen en casi todos los tipos de células en diferentes especies10. La dinámica de las gotas de lípidos, incluyendo su tamaño y número, cambia en respuesta a los factores estresantes ambientales. Esto se considera como un reflejo del estado metabólico en respuesta al estrés, como el envejecimiento y el hambre7,8. Por lo tanto, es de gran importancia desarrollar un método factible y confiable para determinar cualitativamente la dinámica de las gotas lipídicas en los enocitos durante el desarrollo y en condiciones estresantes. En particular, en la tercera larva instar, los enocitos contienen pocas o ninguna gotita de lípidos detectables en condiciones de alimentación, pero contienen numerosas gotas de lípidos grandes después de la privación nutricional4. Para verificar la eficacia de este método, se sugiere realizar la tinción de gotas de lípidos en los enocitos en condiciones de hambre.
Actualmente, varios colorantes lipofílicos están disponibles para las manchas de gotas lipídicas, tales como los colorantes no fluorescentes Sudán Negro y Aceite Rojo O y los colores fluorescentes Nilo Rojo y BODIPY 493/50311. Sudán Negro y Aceite Rojo O se utilizan comúnmente para ésteres de colesteryl tejido y triacilgroles y pueden ser fácilmente detectados por microscopía de luz. Sin embargo, la tinción de fondo relativamente alta y una resolución relativamente baja son dos factores limitantes para sus aplicaciones en el análisis cualitativo de la dinámica de las gotas lipídicas. Para superar las limitaciones de los colorantes no fluorescentes, Nile Red y BODIPY 493/503 se utilizan como sustitutos ideales para la tinción de gotas de lípidos. Se ha informado que el rojo del Nilo también puede detectar algún colesterol no esterificado, lo que hace que BODIPY 493/503 sea un tinte más específico para las gotas de lípidos celulares, hasta cierto punto12,13,14.
Sobre todo, para satisfacer la necesidad de un análisis rápido y sensible de las gotas lipídicas en los enocitos, este protocolo presenta un método factible y altamente reproducible de tinción específica de gotas de lípidos a base de fijación utilizando BODIPY 493/503 como tinte de mancha. En este informe, los olores se diseccionan, y BODIPY 493/503 se utiliza para la tinción de gotas lipídicas en los enocitos, en los que las gotas lipídicas se detectan mediante microscopía confocal. La facilidad y asequibilidad de este procedimiento lo hacen ideal para su modificación y uso posterior en otras aplicaciones, como la citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entre los descritos anteriormente, hay varios pasos críticos en este protocolo, con el período de tiempo de puesta de huevos siendo uno de estos. Como tejido movilizador de lípidos, el enocito es altamente sensible al estado nutricional6,8. Los períodos prolongados de tiempo de puesta de huevos pueden dar lugar a larvas cantosas y a una mayor competencia alimentaria, lo que conduce a resultados inexactos. El período de tiempo de puesta de huevos de 1 h utili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31671422, 31529004 y 31601112), el Proyecto 111 (D18010), el Proyecto Local de Equipos de Innovación e Investigación del Programa de Talentos del Río Guangdong Perl (2017BT01S155), y el Fundación De Ciencia Postdoctoral de China (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
Riferimenti
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