Hemocompatibility Testning av blod-kontaktimplantat i en Flow Loop Modell Härma humant blodflöde
Summary
Detta protokoll beskriver en omfattande hemocompatibility utvärdering av blod-kontakta enheter med laser-cut neurovaskulära implantat. En flödesslinga modell med färskt, heparinerat mänskligt blod appliceras för att efterlikna blodflödet. Efter perfusion analyseras olika hematologic markörer och jämförs med de värden som vunnits direkt efter blodinsamling för hemokompatibilitetsutvärdering av de testade enheterna.
Abstract
Den ökande användningen av medicintekniska produkter (t.ex. kärltransplantat, stent och hjärtkatetrar) för tillfälliga eller permanenta ändamål som finns kvar i kroppens cirkulationssystem kräver en tillförlitlig och multiparametrisk metod som utvärderar de möjliga hematologiska komplikationer som orsakas av dessa enheter (dvs. aktivering och förstörelse av blodkomponenter). Omfattande in vitro hemocompatibility testning av blod-kontakta implantat är det första steget mot ett framgångsrikt in vivo genomförande. Därför är omfattande analyser enligt Internationella standardiseringsorganisationen 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk före klinisk tillämpning. Den presenterade flödesslingan beskriver en känslig modell för att analysera stentens hemostatiska prestanda (i detta fall neurovaskulära) och avslöja negativa effekter. Användning av färskt urblod från människa och mild blodprov är avgörande för att undvika föraktivering av blod. Blodet perfunderas genom ett heparinerat rör som innehåller provexemplaret med hjälp av en peristaltisk pump med en hastighet av 150 ml/min vid 37 °C i 60 min. Före och efter perfusion, hematologiska markörer (dvs. antal blodkroppar, hemoglobin, hematokrit och plasmatiska markörer) som indikerar aktivering av leukocyter (polymorfonukleära [PMN]-elastas), trombocyter (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulationssystemet (thombin-antithrombin III [TAT]) och komplementkaskaden (SC5b-9) analyseras. Sammanfattningsvis presenterar vi en viktig och tillförlitlig modell för omfattande hemokompatibilitetstestning av stent och andra blodkontaktiga enheter före klinisk tillämpning.
Introduction
In vivo-applicering av implantat och biomaterial, som interagerar med humant blod, kräver intensiva prekliniska tester med fokus på undersökning av olika markörer för hemostatiska systemet. Internationella standardiseringsorganisationen 10993-4 (ISO 10993-4) specificerar de centrala principerna för utvärdering av blodkontaktutrustning (dvs. stent och kärltransplantat) och anser att enhetens design, klinisk nytta och material som behövs1.
Humant blod är en vätska som innehåller olika plasmaproteiner och celler, inklusive leukocyter (vita blodkroppar [WBCs]), erytrocyter (röda blodkroppar [CFC]) och trombocyter, som utför komplexa funktioner i människokroppen2. Direktkontakt av främmande material med blod kan orsaka negativa effekter, såsom aktivering av immun- eller koagulationssystemet, vilket kan leda till inflammation eller trombotiska komplikationer och allvarliga problem efter implantation3,4,5. Därförerbjuder in vitro hemocompatibility validering en möjlighet före implantation att upptäcka och utesluta eventuella hematologic komplikationer som kan induceras vid kontakt med blodet med en främmande yta6.
Den presenterade flödesslingan modellen inrättades för att bedöma hemokompatibilitet en neurovaskulär stent och liknande enheter genom att tillämpa ett flöde på 150 ml/min i slangar (diameter 3,2 mm) för att efterlikna cerebrala flödesförhållanden och artärdiametrar2,7. Förutom behovet av en optimal in vitro-modell är källan till blod en viktig faktor för att få tillförlitliga och oförändrade resultat vid analys av hemokompatibilitet hos ett biomaterial8. Det insamlade blodet ska användas omedelbart efter provtagning för att förhindra förändringar orsakade av långvarig förvaring. I allmänhet bör en mild blodsamling utan stasis med en 21 G-nål utföras för att minimera preaktivering av blodplättar och koaguleringskaskaden under blodprovskaskaden under blodprovstagningen. Dessutom, givare uteslutning kriterier inkluderar dem som röker, är gravida, är i ett dåligt hälsotillstånd, eller har tagit p-piller eller smärtstillande medel under de senaste 14 dagarna.
Denna studie beskriver en in vitro-modell för omfattande hemokompatibilitetstestning av stentimplantat under flödesförhållanden. Vid jämförelse obestruken med fibrin-heparin-belagda stent, återspeglar resultaten av de omfattande hemokompatibilitetstesterna förbättrad hemokompatibilitet hos fibrin-heparin-belagda stent9. Däremot inducerar de obelagda stenten aktivering av koagulationskaskaden, vilket framgår av en ökning av thombin-antitrombin III (TAT) koncentrationer och förlust av blodplättsnummer på grund av vidhäftning av trombocyter till stentyta. Sammantaget rekommenderas integrering av denna hemocompatibility-modell som ett prekliniskt test för att upptäcka eventuella negativa effekter på hemostatiska systemet som orsakas av enheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver en omfattande och tillförlitlig metod för hemokompatibilitetstestning av blodkontaktiga implantat i enlighet med ISO 10993-4 i en skjuvflödesmodell som imiterar mänskligt blodflöde. Denna studie är baserad på testning av laser-cut neurovaskulära implantat men kan utföras med en mängd olika prover. Resultaten visar att denna metod möjliggör en bred analys av olika parametrar såsom antalet blodkroppar, prevalens av flera hemokompatibilitetsmarkörer och mikroskopisk visua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
För prestanda navelektronmikroskopi tackar vi Ernst Schweizer från sektionen av Medicinsk materialvetenskap och teknik vid Universitetssjukhuset Tuebingen. Forskningen stöddes av ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i CR inom National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) och av Tjeckiska Science Foundation projekt nr 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
