인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트
Summary
이 프로토콜은 레이저 컷 신경 혈관 임플란트를 사용하여 혈액 접촉 장치의 포괄적 인 혈전 성 평가를 설명합니다. 신선한, 헤파린화 인간의 혈액과 흐름 루프 모델은 혈류를 모방하기 위해 적용됩니다. 관류 후, 다양한 혈액학적 마커를 분석하고 시험된 장치의 혈적합성 평가를 위해 혈액 수집 직후 얻은 값과 비교한다.
Abstract
신체의 순환 계통에 남아 있는 일시적 또는 영구적 목적을 위해 의료 기기(예: 혈관 이식편, 스텐트 및 심장 카테터)의 사용이 증가함에 따라 이러한 장치(즉, 혈액 구성 요소의 활성화 및 파괴)로 인한 가능한 혈액학적 합병증을 평가하는 신뢰할 수 있고 다중파라메트릭 접근법이 필요합니다. 혈액 접촉 임플란트의 포괄적인 체외 혈우적합성 검사는 생체 내 성공적인 구현을 향한 첫 번째 단계입니다. 따라서 국제표준화기구(ISO 10993-4)에 따른 광범위한 분석은 임상 적용 전에 필수적이다. 제시된 흐름 루프는 스텐트의 지혈 성능을 분석하고(이 경우 신경혈관) 부작용을 드러내는 민감한 모델을 설명합니다. 신선한 인간의 전혈과 부드러운 혈액 샘플링의 사용은 혈액의 사전 활성화를 피하기 위해 필수적이다. 혈액은 60 분 동안 37 °C에서 150 mL / min의 속도로 연동 펌프를 사용하여 시험편을 포함하는 헤파린화 튜브를 통해 관류된다. 관류 전후, 혈액학적 마커(즉, 혈액 세포 수, 헤모글로빈, 헤마토크리트 및 혈장 마커)의 활성화를 나타내는 백혈구(다형성핵[PMN]-엘라스타제), 혈소판(β-트롬보글로불린[β-TG]), 응고 시스템(톰빈-항트롬빈 III [TAT]), 및 상보(SCb)의 상호작용(SCb)이 분석된다. 결론적으로, 우리는 임상 적용 전에 스텐트 및 기타 혈액 접촉 장치의 광범위한 혈우적합성 테스트를 위한 필수적이고 신뢰할 수 있는 모델을 제시합니다.
Introduction
인간의 혈액과 상호 작용하는 임플란트 및 생체 재료의 생체 내 응용 프로그램은 지혈 시스템의 다양한 마커의 조사에 초점을 맞춘 강렬한 전임상 테스트가 필요합니다. 국제표준화기구(ISO 10993-4)는 혈액 접촉 장치(즉, 스텐트 및 혈관 이식편)의 평가를 위한 핵심 원칙을 명시하고 장치 설계, 임상 적 유용성 및 필요한 물질을 고려합니다1.
인간의 혈액은 백혈구(백혈구[WBC]), 적혈구(적혈구[RBC]) 및 혈소판을 포함하는 다양한 혈장 단백질 및 세포를 포함하는 유체이며, 이는 인체에서 복잡한 기능을 수행한다2. 혈액과 이물질의 직접적인 접촉은 면역 또는 응고 시스템의 활성화와 같은 부작용을 일으킬 수 있으며, 이는 이식 후 염증 또는 혈전 합병증 및 심각한 문제로 이어질 수 있습니다3,4,5. 따라서, 시험관내 혈적합성 검증은 이식 전에 외래 표면과의 혈액 접촉시 유도될 수 있는 임의의 혈액학적 합병증을 검출하고 배제할 수 있는 기회를 제공한다6.
제시된 플로우 루프 모델은 뇌유동 조건 및 동맥직경을모방하기 위해 튜브(직경 3.2 mm)에 150 mL/min의 유량을 적용하여 신경혈관 스텐트 및 유사한 장치의 혈적합성을 평가하기 위해 설립되었다2,7. 생체외 에서 최적 모형을 위한 필요 이외에, 혈액의 근원은 생체 재료의 혈적합성을 분석할 때 믿을 수 있고 변경되지 않은 결과를 얻기에 있는 중요한 요인8입니다. 수집 된 혈액은 장기간 저장으로 인한 변화를 방지하기 위해 샘플링 후 즉시 사용해야합니다. 일반적으로, 21 G 바늘을 사용하여 정지없이 혈액의 부드러운 수집은 혈액 드로잉 동안 혈소판 과 응고 캐스케이드의 사전 활성화를 최소화하기 위해 수행되어야한다. 또한, 기증자 배제 기준은 담배를 피우거나, 임신 중이거나, 건강상태가 좋지 않거나, 지난 14일 동안 경구 피임약이나 진통제를 복용한 사람들을 포함합니다.
본 연구는 유동 조건하에서 스텐트 임플란트의 광범위한 혈우병 성 테스트를 위한 시험관내 모델을 설명합니다. 피브린 헤파린 코팅 스텐트와 코팅되지 않은 스텐트를 비교할 때, 포괄적인 혈우적합성 테스트 결과는 피브린 헤파린 코팅 스텐트의 향상된 혈호환성을 반영합니다9. 대조적으로, 코팅되지 않은 스텐트는 혈소판이 스텐트 표면에 부착되기 때문에 톰빈-항트롬빈 III(TAT) 농도의 증가 및 혈소판 수의 손실에 의해 입증된 바와 같이 응고 캐스케이드의 활성화를 유도한다. 전반적으로, 전임상 시험으로 이 혈적합성 모형을 통합하는 것은 장치에 기인하는 지혈시스템에 어떤 불리한 효력든지 검출하기 위하여 추천됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 인간의 혈류를 모방하는 전단 흐름 모델에서 ISO 10993-4에 따라 혈액 접촉 임플란트의 혈중 호환성 테스트를 위한 포괄적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 연구는 레이저 컷 신경 혈관 임플란트의 테스트를 기반으로하지만 다양한 샘플로 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 혈액 세포 수, 여러 혈우적합성 마커의 보급, 혈액 접촉 후 장치 표면의 현미경 시각화와 같은 다양…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
주사 전자 현미경의 성능을 위해, 우리는 대학 병원 Tuebingen의 의료 재료 과학 기술의 섹션에서 Ernst 슈바이저 감사합니다. 이 연구는 국가 지속 가능성 프로그램 II (프로젝트 BIOCEV-FAR LQ1604) 및 체코 과학 재단 프로젝트 No. 18-01163S 내에서 CR의 교육, 청소년 및 스포츠 부처에 의해 지원되었습니다.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
