בדיקות הומותאימות של דם-יצירת קשר שתלים בלופ זרימה לולאה דגם מחקה זרימת הדם האנושית
Summary
פרוטוקול זה מתאר הערכת התאמה מקיפה של התקנים ליצירת קשר דם באמצעות שתלים נוירונימי לייזר. מודל לולאה של זרימה עם דם האדם טרי, heparinized מוחל כדי לחקות את זרימת הדם. לאחר הפרזיה, סמנים המטולוגיים שונים מנותח ומושווים לערכים שנרכשו ישירות לאחר איסוף הדם להערכת התקנים של המכשירים שנבדקו.
Abstract
השימוש הולך וגובר של מכשירים רפואיים (למשל, שתלי כלי דם, סטנטים, וקטטרים לב) למטרות זמניות או קבועות שנשארות במערכת הדם של הגוף דורש גישה אמינה ופרמטרית שתוצאתה הסיבוכים המטולוגיים האפשריים שנגרמו על ידי התקנים אלה (כלומר, הפעלה והשמדה של רכיבי דם). בדיקות מקיפות של השתלת מבחנה של שתלים ליצירת קשר דם היא הצעד הראשון לקראת הצלחה במימוש vivo. לכן, ניתוח מקיף על פי הארגון הבינלאומי לתקינה 10993-4 (ISO 10993-4) הוא הכרחי לפני היישום הקליני. לולאת הזרימה המוצגת מתארת מודל רגיש לניתוח הביצועים הסטטיים של סטנטים (במקרה זה, נוירונימי) וחשיפת תופעות לוואי. השימוש בדם האנושי הטרי ודגימת דם עדינה הם חיוניים כדי למנוע את ההפעלה של דם. הדם מכיל דרך אבובים heparinized המכיל את הדגימה באמצעות משאבה קנולות בקצב של 150 mL/min ב 37 ° צ’ עבור 60 דקות. לפני ואחרי הפרזיה, סמנים המטולוגיים (כלומר, ספירת תאי הדם, המוגלובין, המטוקריט וסמני הפלסטלינה) המציינים את הפעלת הלוקוציטים (פולימלטיות ברורות [PMN]-elastase), טסיות (β-thromboglobulin [β-TG]), מערכת קרישת הדם (תוממבין-אנטיתרומבין III [תאת]), והמפל המשלים (SC5b -9) מנותח לסיכום, אנו מציגים מודל חיוני ואמין עבור בדיקות הומותאימות נרחבת של סטנטים והתקנים אחרים ליצירת קשר דם לפני היישום הקליני.
Introduction
ביישום vivo של שתלים וביואטילים, אשר אינטראקציה עם דם אנושי, דורש אינטנסיבי בדיקות טרום קלינית התמקדות בחקירת סמנים שונים של המערכת המוסטטית. הארגון הבינלאומי לתקינה 10993-4 (ISO 10993-4) מציין את העקרונות המרכזיים להערכת מכשירים ליצירת קשר דם (קרי, סטנטים ושתלי כלי הדם) ורואה בעיצוב ההתקן, בכלי העזר הקליני ובחומרים הדרושים1.
דם אנושי הוא נוזל המכיל חלבונים ותאים שונים פלזמה, כולל לוקיציטים (כדוריות דם לבנות [WBCs]), אריתרופוציטים (כדוריות דם אדומות [RBCs]), וטסיות, אשר לבצע פונקציות מורכבות בגוף האדם2. המגע הישיר של חומרים זרים עם דם יכול לגרום לתופעות לוואי, כגון הפעלה של מערכת החיסון או קרישת הדם, אשר יכול להוביל לדלקת או סיבוכים טרומבוטיים ובעיות חמורות לאחר השרשה3,4,5. לפיכך, באימות מחוץ לגופית מציעה הזדמנות לפני השרשה כדי לזהות ולא לכלול סיבוכים המטולוגיים שעלולים להיגרם על ידי מגע הדם עם משטח זר6.
מודל לולאה של זרימה הציג הוקמה כדי להעריך את ההזרמת ההפרעות של סטנטים נוירוכלי והתקנים דומים על ידי החלת שיעור הזרימה של 150 mL/min ב אבובים (קוטר של 3.2 מ”מ) כדי לחקות את תנאי הזרימה מוחין ו קטרים העורק2,7. מלבד הצורך האופטימלי במודל מתורבת, מקור הדם הוא גורם חשוב בהשגת תוצאות אמינות ולא שינה כאשר מנתחים את התאימות של ביומטריה8. את הדם שנאסף יש להשתמש מיד לאחר הדגימה כדי למנוע שינויים שנגרמו על ידי אחסון ממושך. באופן כללי, אוסף עדין של דם ללא קיפאון באמצעות מחט G 21 יש לבצע כדי למזער את ההפעלה של טסיות ו קרישה מדורגת במהלך ציור דם. יתרה מזאת, הקריטריונים להדרה של תורמים כוללים את אלה המעשנים, בהריון, נמצאים במצב בריאותי גרוע, או שלקחו גלולות למניעת הריון או משככי כאבים במהלך 14 הימים הקודמים.
מחקר זה מתאר מודל בלתי מתורבת עבור בדיקות המוחלות הנרחבות של שתלים סטנט בתנאי זרימה. כאשר השוואת בלתי מצופה של סטנטים מצופים בפירין-הפארין, תוצאות הבדיקות המקיפות הינן משקפות הומותאימות משופרת של סטנטים מצופים בפירין-הפארין9. לעומת זאת, סטנטים בלתי מצופים מגבירים את הפעלת הקרישה, כפי שניתן להדגים באמצעות גידול ב-thombin-אנטיתרומבין III (תאת) ריכוזים ואובדן מספרי טסיות דם בשל הדבקה של טסיות למשטח סטנט. באופן כללי, שילוב מודל התקן התקן זה כמבחן טרום קליני מומלץ לאתר תופעות לוואי על מערכת ההסטטית הנגרמת על ידי המכשיר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה מקיפה ואמינה לבדיקת תאימות בדיקות דם שתלים בהתאם ISO 10993-4 במודל זרימת הטיה החיקוי של זרימת הדם האנושית. מחקר זה מבוסס על בדיקות של שתלים נוירוכלי לייזר לחתוך, אבל ניתן לבצע עם מגוון רחב של דגימות. התוצאות מראות ששיטה זו מאפשרת ניתוח נרחב של פרמטרים שונים כגון ספירת ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
על הביצועים של סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני, אנו מודים לארנסט שוויצר מתוך סעיף של מדעי החומרים הרפואיים והטכנולוגיה של בית החולים האוניברסיטאי טואבינגן. המחקר נתמך על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של CR בתוך התוכנית הלאומית הסביבתית השנייה (פרויקט BIOCEV-FAR LQ1604) ועל ידי קרן המדע הצ פרויקט מס ‘ 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
