Summary

Combinazione di microdissezione laser di cattura e qPCR microfluidico per analizzare i profili trascrizionali di singole cellule: un approccio di biologia dei sistemi alla dipendenza da oppioidi

Published: March 08, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo spiega come raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell’amigdala con alta precisione e specificità anatomica utilizzando la microdissezione di cattura laser. Inoltre, spieghiamo il nostro uso di RT-qPCR microfluidico per misurare un sottoinsieme del trascrittoma di queste cellule.

Abstract

La profonda eterogeneità trascrizionale nelle singole cellule anatomicamente adiacenti suggerisce che la robusta funzionalità dei tessuti può essere ottenuta dalla diversità del fenotipo cellulare. Gli esperimenti a una cellula che studiano le dinamiche di rete dei sistemi biologici dimostrano risposte cellulari e tissutali a varie condizioni a risoluzione biologicamente significativa. Qui, spieghiamo i nostri metodi per raccogliere singole cellule da luoghi anatomicamente specifici e misurare accuratamente un sottoinsieme dei loro profili di espressione genica. Uniamo la microdisezione di cattura laser (LCM) con le reazioni della catena quantitativa di trascrizione inversa microfluidica (RT-qPCR). Usiamo anche questa piattaforma microfluidica RT-qPCR per misurare l’abbondanza microbica del contenuto intestinale.

Introduction

La misurazione dei profili di espressione genica di singole cellule ha dimostrato un’ampia eterogeneità fenotipica all’interno di un tessuto. Questa complessità ha complicato la nostra comprensione delle reti biologiche che governano la funzione dei tessuti. Il nostro gruppo e altri hanno esplorato questo fenomeno in molti tessuti e condizioni1,2,3,4,5,6. Questi esperimenti non solo suggeriscono che la regolazione delle reti di espressione genica è alla base di tale eterogeneità, ma anche che la risoluzione a singola cellula rivela una complessità nella funzione tissutale che la risoluzione a livello di tessuto non riesce ad apprezzare. Infatti, solo una piccola minoranza di cellule può rispondere a una condizione o a una sfida specifica, ma l’impatto di tali cellule sulla fisiologia generale può essere sostanziale. Inoltre, un approccio di biologia del sistema che applica metodi multivariati a set di dati ad alta dimensione da più tipi di cellule e tessuti può chiarire gli effetti di trattamento a livello di sistema.

Uniamo LCM e RT-qPCR microfluidico per ottenere tali set di dati. Adottiamo questo approccio qui in contrasto con la raccolta di singole cellule tramite lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e l’utilizzo del sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) per misurare il loro trascrittoma. Il vantaggio di LCM rispetto a FACS è che l’esatta specificità anatomica delle singole celle può essere documentata con LCM, relativamente e assolutamente. Inoltre, mentre RNA-seq può misurare più caratteristiche che RT-qPCR, RT-qPCR microfluidico è meno costoso e ha una maggiore sensibilità e specificità7.

In questo esperimento rappresentativo, abbiamo studiato gli effetti della dipendenza da oppioidi e del ritiro degli oppioidi precipitati da naltrexone sul ratto neuronale, microglia, e l’espressione del gene astrocito nel nucleo centrale dell’amigdala (CeA) e della micro abbondanza intestinale4 . Sono stati analizzati quattro gruppi di trattamento: 1) Placebo, 2) Morphine, 3) Naltrexone e 4) Ritiro (Figura 1). Abbiamo scoperto che la dipendenza da oppioidi non alterava sostanzialmente l’espressione genica, ma che il ritiro da oppioidi indusse l’espressione di geni infiammatori, in particolare Tnf. Gli astrociti erano il tipo di cellula più colpita. Il microbioma intestinale è stato profondamente influenzato dal ritiro da oppioidi come indicato da una diminuzione del rapporto Firmicutes a Bacteroides, che è un marcatore stabilito della disbiosi intestinale8,9.

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni di Animal Care and Use Committee (IACUC) di Thomas Jefferson University e Drexel University College of Medicine. Il protocollo è stato approvato dalla Thomas Jefferson University e Drexel University College of Medicine IACUC. 1. Modello animale Inserire due pellet di solfato di morfina a lento rilascio 75 mg o due pellet placebo sottocutanei in ratti Maschi Maschi Adulti Sprague-Dawley. Utilizzare un abito…

Representative Results

La selezione delle singole cellule è stata convalidata sia visivamente che molecolarmente. Visivamente, la morfologia cellulare è stata vista prima della raccolta delle cellule. Le cellule raccolte sono state poi viste alla stazione QC e la macchia dei nuclei cellulari (DAPI) si sovrapponeva alla fluorescenza del marcatore di selezione cellulare. Figura 2A mostra le immagini rappresentative di una diapositiva con prosencefalo del ratto emis…

Discussion

La biologia a cellula singola ha dimostrato l’eterogeneità dei fenotipi cellulari e la robustezza della funzione tissutale. Questi risultati hanno fornito informazioni sull’organizzazione dei sistemi biologici sia su macro che su microscala. In questo caso, descriviamo la combinazione di due metodi, LCM e qPCR microfluidico, per ottenere misure di trascrittoma a cella singola che forniscono specificità anatomica e precisione trascrizionale a un costo relativamente basso (Figura 1). Il nost…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro qui presentato è stato finanziato tramite NIH HLB UL1 33360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS ed EVB, e T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO’S.

Materials

20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-48.48 NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
GFAP Monoclonal Antibody ThermoFisher Scientific A-21294 Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A28175 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA

Riferimenti

  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  4. O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

Play Video

Citazione di questo articolo
O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence. J. Vis. Exp. (157), e60612, doi:10.3791/60612 (2020).

View Video