Summary
Aqui, apresentamos a caracterização molecular da expressão distrofina 38 usando sequenciamento Sanger, RT-PCR e mancha ocidental no ensaio clínico.
Abstract
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular degenerativa que causa perda progressiva de massa muscular, levando à morte prematura. As mutações muitas vezes causam um quadro de leitura distorcido e códons de parada prematura, resultando em uma quase total falta de proteína de distrofina. O quadro de leitura pode ser corrigido usando oligonucleotídeos antissamo-americanos (AONs) que induzem o salto de exon. O morfolino AON viltolarsen (codinome: NS-065/NCNP-01) mostrou-se induzir exon 53 pulando, restaurando o quadro de leitura para pacientes com exon 52 exclusões. Recentemente, administramos o NS-065/NCNP-01 por via intravenosa em pacientes com DMD em um teste exploratório iniciado por investigadores, primeiro em humanos do NS-065/NCNP-01. Neste artigo de métodos, apresentamos a caracterização molecular da expressão da distrofina usando sequenciamento Sanger, RT-PCR e mancha ocidental no ensaio clínico. A caracterização da expressão da distrofina foi fundamental no estudo para mostrar a eficácia, uma vez que não foram realizados testes de desfecho funcional.
Introduction
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular degenerativa que causa perda progressiva de massa muscular, insuficiência respiratória e cardiomiopatia, e leva à morte prematura1. A doença é causada pela falta da grande distropina de proteína muscular estrutural2. Mutações no gene DMD no cromossomo X são recessivas, e a doença afeta 1 em 3500-5000 machos recém-nascidos3,,4,,5. As mutações são muitas vezes grandes supressões em uma região de hotspot entre os exons 44 e 55 que levam a um quadro de leitura distorcido e códons de parada prematura, causando decadência mediada sem sentido e uma quase total falta de proteína distrofina6,,7,,8. O quadro de leitura pode ser corrigido usando oligonucleotídeos antissamo-americanos (AONs) que induzem o exon pular e restaurar o quadro de leitura, restaurando parcialmente a expressão da distrofina e atrasando a progressão da doença9,,10,,11. O eteplirsen morpholino AON, que foi recentemente aprovado pela Agência Federal de Drogas (FDA), induz a pular do exon 51 e pode restaurar o quadro de leitura em pacientes com exon 52 deleções12,13. No entanto, o exon 53 pulando restaura o quadro de leitura para pacientes com exon 52 exclusões, e pode potencialmente tratar aproximadamente 10% dos pacientes DMD14. A droga morpholino AON NS-065/NCNP-01 tem sido demonstrada para induzir exon 53 pulando em células humanas, e recentemente administramos o NS-065/NCNP-01 a pacientes com DMD em um ensaio clínico de dose-escalonamento de rótulo aberto de fase 1 (doravante, chamado de "estudo") (registrado como UMIN: 000010964 e ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. O estudo mostrou um aumento dependente de dose de exon 53 pulando com base nos níveis de proteína RT-PCR e distrofina com base na mancha ocidental, e nenhum evento adverso grave ou abandono foi observado14.
Em todos os ensaios clínicos, a análise dos resultados é de suma importância. Para os ensaios clínicos da DMD, ainda está em curso um debate sobre o melhor método para mostrar um benefício de tratamento. Testes clínicos como o teste de caminhada de 6 minutos têm certas desvantagens. A caracterização molecular da expressão da distrofina pode ser realizada usando vários métodos, como RT-PCR, qPCR, digital-PCR, mancha ocidental e imunohistoquímica. No entanto, a extensão da restauração da expressão proteica que é necessária para transmitir um benefício clínico permanece incerta. Neste artigo de métodos, descrevemos detalhadamente os métodos de rt-PCR e de manchas ocidentais utilizados para determinar os níveis de exon skipping e proteína, respectivamente, no ensaio fase 1 da droga de pular AON NS-065/NCNP-0114.
Protocol
O procedimento operacional para o julgamento iniciado pelo investigador foi aprovado pelo comitê de ética do NCNP (ID de aprovação: A2013-019).
1. Preparação de amostras musculares
NOTA: Os músculos bíceps braquii ou quadríceps são frequentemente selecionados como locais de biópsia. No entanto, a tibialis anterior foi utilizada no ensaio clínico.
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Biópsia muscular de pacientes
- Marque o local da incisão antes da preparação da pele.
- Prepare gaze umedecida para a biópsia. Aperte bem a gaze.
- Injete anestesia local na pele e tecido subcutâneo, mas não no músculo. Certifique-se da profundidade da anestesia pela ausência de dor cutânea.
NOTA: A anestesia geral é geralmente usada em pacientes pediátricos com menos de 15 anos de idade. - Faça uma incisão da pele para o tecido subcutâneo. Use pequenos retráteis para abrir a incisão e separar a gordura subcutânea.
NOTA: Nesta etapa, uma porção da pele pode ser cortada para a cultura do fibroblasto. - Faça outra pequena incisão na fáscia e corte ainda mais a fáscia. Aperte as bordas usando fórceps de mosquitos para expor o músculo.
- Use uma sutura para puxar a porção selecionada do músculo. Faça um pequeno túnel usando tesouras Iris e insira fórceps de mosquitos no túnel.
- Separe o feixe muscular usando fórceps e corte ambas as extremidades da porção alvo.
NOTA: As amostras de biópsia muscular devem ser do tamanho de um lápis para pacientes adultos (comprimento de 1,0-1,5 cm, diâmetro de 0,8-1,0 cm). A amostra deve ter cerca de 1 cm de comprimento e 5 mm de diâmetro em pacientes pediátricos. - Enrole o espécime em gaze amedracida com soro fisiológico e transporte o músculo fresco à temperatura ambiente (RT) imediatamente para uma instalação onde o espécime possa ser preparado para análise suplementar.
NOTA: As amostras devem ser transportadas a 4 °C se a duração do transporte exceder 1 hora.
2. Preparação da amostra muscular
- Misture volumes iguais de goma e água até que a gengiva fique macia e pegajosa. Coloque a mistura em seringas de 25 mL. As seringas podem ser armazenadas em uma geladeira.
- Coloque aproximadamente 0,5 a 1 cm de goma de tragacanth em discos de cortiça. Rotule os discos do lado oposto.
- Coloque um recipiente de isopentane em nitrogênio líquido até que parte do líquido congele.
- Coloque o espécime na goma tragacanth. O eixo longitudinal de cada músculo deve ser perpendicular à rolha. Coloque chiclete na parte inferior de cada músculo para ajudar na colocação adequada.
- Utilizando pinças, coloque a amostra de músculo/rolha em isopentane fria preparada na etapa 2.3 para congelar. Mova o espécime constantemente por 1 minuto ou até ficar completamente congelado, e coloque em gelo seco temporariamente.
- Coloque o espécime em frascos de vidro e armazene a -80 °C.
3. Seção muscular
- Configure o criostat para seção com uma temperatura de trabalho de -25 °C.
- Monte o bloco de cortiça/músculo e corte até que as seções planas sejam alcançadas.
- Use uma espessura de seção de 10 μm para RT-PCR e mancha ocidental. Use uma espessura de 6-8 μm e 10-12 μm para imunohistoquímica ou hematóxilina e eosina, respectivamente. Coloque seções fatiadas em tubos de 2,0 mL e armazene a -80 °C para RT-PCR e manchas ocidentais.
4. Extração de RNA e reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR)
- Extrair aproximadamente 10 fatias com 10 μm de espessura do músculo congelado por um criostat. Colete o RNA total purificado usando o kit de purificação do RNA total de acordo com as instruções do fabricante.
- Meça a concentração de RNA usando um espectrômetro.
- Combine os reagentes necessários para uma reação RT-PCR em tubos PCR de acordo com a Tabela 1. Consulte a Tabela 2 para obter sequências de primer.
NOTA: A cartilha dianteira foi de 44F para paciente NS-03 e 46F para paciente NS-07. O primer reverso era 54/55R como padrão. Se os produtos não específicos fossem evidentes, o 54R foi utilizado como alternativa. - Coloque os tubos PCR contendo a mistura em um termociclador. Execute o termociclador de acordo com a Tabela 3.
- Armazene o produto PCR a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.
5. Cálculo de eletroforese de microchip e exon skipping
NOTA: Um sistema de eletroforese de microchip (MCE) é frequentemente selecionado para analisar a eficiência de salto de exon. Neste protocolo, descrevemos as etapas necessárias para analisar a eficiência de salto de exon usando um sistema MCE pelo fabricante A, bem como do fabricante B, a partir de agora chamado sistema A e B. Durante o ensaio clínico, o exon pulando eficiência foi analisado no sistema A. No entanto, o sistema A não está mais à venda, e recomendamos que o sistema B analise a eficiência de exon skipping. Incluímos protocolos para ambos os sistemas (ver seção 5.1 para o sistema A e 5.2 para o sistema B). Consulte Tabela de Materiais para obter informações sobre os sistemas A e B. Além disso, essa etapa também pode ser realizada com eletroforese de gel de agarose normal, mas a sensibilidade diminui consideravelmente.
- Eletroforese de microchip usando o sistema A
NOTA: O Sistema A tem dois tipos de chips. Aqui, descrevemos os passos para o chip de DNA.- Reagentes do kit de equilíbrio (tampão de manchas, tampão de carga, escada e tampão de gel) para RT, vórtice e girar para baixo.
- Para preparar o tampão de gel-mancha (GS), adicione 12,5 μL de tampão de manchas a 250 μL de tampão de gel e vórtice para 10 s. Mova a solução para um tubo de filtro de giro e centrífuga a 2.400 x g por 15 min. Descarte o filtro.
NOTA: O GS filtrado pode ser armazenado a 4 °C durante 1 mês. - Se as amostras estiverem altamente concentradas, dilui-se para aproximadamente 50 ng/μL com tampão de TE ou água sem DNase.
NOTA: Se as amostras estiverem em uma concentração de sal ≥ 200 mM KCl (ou NaCl) e/ou 15 mM MgCl2, troque o buffer. - Adicione 12 μL de solução GS ao poço de escoramento de gel (destacado e rotulado GS) do chip de DNA e coloque o chip na estação de escoramento.
NOTA: Para evitar bolhas de ar, insira a ponta da pipeta verticalmente e na parte inferior do poço durante a dispensação. Dispense lentamente até a primeira parada na pipeta e não expulse o ar no final da etapa de pipetação. - Selecione o modo C3 e pressione o botão Iniciar. Depois que a preparação for concluída, remova o chip.
- Inspecione visualmente os microcanais para obter bolhas de ar presas ou escoramento incompleto.
- Carregue as amostras preparadas e a escada no chip como abaixo.
- Pipeta 9 μL de solução GS nos outros poços de 3 GS.
- Pipeta 5 μL de tampão de carga no poço L e cada amostra bem (1-11).
- Pipeta 1 μL de escada no poço L.
- Pipeta 1 μL de amostra de DNA em cada um dos 11 poços amostrais.
- Pipeta 1 μL de água sem TE ou DNase em quaisquer poços nãousados. O guia rápido do kit mostra uma figura do layout do chip.
NOTA: Inspecione todos os poços em busca de bolhas de ar segurando o chip acima de um fundo levemente colorido. Desalojar quaisquer bolhas de ar presas na parte inferior de um poço com uma ponta de pipeta limpa ou removendo e recarregando a solução.
- Coloque o chip na estação vórtice e pressione Mix. A estação de vórtice pára automaticamente após 1 min.
- Execute o chip na estação de eletroforese dentro de 5 minutos de carregamento.
- Selecione New Run na barra de ferramentas do software. Na tela do New Run, selecione DNA e DNA 1K da lista de pull-down do Ensaio.
- Selecione uma pasta de projeto para execução da lista de retirada do Projeto ou crie uma nova pasta de projeto inserindo um nome no campo Projeto.
- Digite um nome para a execução no campo Executar Prefixo e clique em Iniciar Execução.
- O instrumento emite um bipe quando a análise está completa, e uma janela se abre indicando o fim da corrida. Selecione OK e remova o chip da plataforma de chips.
- Selecionar arquivo | Exportar dados para exportar os dados. Selecione as opções desejadas no diálogo Exportar.
- Para limpar os eletrodos, encha um chip de limpeza com 800 μL de água deionizada e coloque-o na plataforma do chip, feche a tampa e deixe-a fechada por 1 min. Depois de 1 min, abra a tampa, retire o chip de limpeza e deixe os eletrodos secarem por 1 min.
- Eletroforese de microchip usando o sistema B
- Abra o software operacional e insira as informações da amostra. Após inserir as informações, o software calcula automaticamente a quantidade de soluções de buffer e marcadores de separação.
- Prepare a quantidade necessária de separação do buffer calculado pelo software. Primeiro, prepare a solução de coloração de gel ácido nucleico 100x diluindo a solução de 10.000x com a quantidade apropriada de tampão de TE. A solução de 100x pode ser armazenada a -20 °C.
- Misture uma quantidade adequada de 100x de óleo de gel nucleico no tubo específico fornecido pela empresa para preparar uma solução 1x. Vórtice a solução.
- Prepare a quantidade necessária de solução de marcador no tubo.
- Inicie o programa de lavagem da sonda.
- Inicie o programa de lavagem de microchips quando terminar.
- Simultaneamente, pipete as amostras para uma placa multiplataques PCR (96-well, clear) e diluir 4 vezes com água deionizada. O volume mínimo que a máquina pode suportar é de 6 μL, e o máximo é de 30 μL. Sugerimos um volume total de 10 μL (2,5 μL de amostra e 7,5 μL de água/te-tampão).
- Cubra as placas com folhas de papel alumínio pcr adesivo e spin-down as amostras.
- Defina a placa, a solução de marcador e 1x separando o buffer na máquina de acordo com a colocação mostrada pela máquina. Pressione o botão Iniciar.
- Quando a execução estiver concluída, exporte os dados de resultado como um arquivo .csv do software e calcule a eficiência de salto do exon usando a concentração molar da seguinte forma:
Exon pulando eficiência (%) = (Banda ignorada / (banda ignorada + banda não-ignorada) X 100
6. Sequenciamento de DNA complementar (cDNA)
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Preparação do gel de Agarose
- Meça 1,5 g de pó de agarose e misture o pó com 100 mL de tampão TAE 1x em um frasco microwavável (resultando em um gel de 1,5% de agarose).
- Micro-ondas por 1-3 min até que a agarose esteja completamente dissolvida.
NOTA: Não sobreboil a solução, uma vez que parte do buffer evaporará e alterará a porcentagem final de agarose do gel. - Deixe a solução agarose esfriar para cerca de 50 °C.
- Adicione 10 μL 10.000x de corante de ácido nucleico fluorescente à solução agarose.
- Despeje a agarose em uma bandeja de gel com o pente-bom no lugar. Deixe em RT por 20-30 min até que tenha se solidificado completamente.
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Seqüenciamento
- Misture 5 μL de produto RT-PCR (a partir da etapa 4.4) e 1 μL de tampão de carga de 6x. Carregue-os nos poços do gel de 1,5%.
- Execute o gel a 135 V por 5 min e 120 V por 20 min.
- Visualize as bandas usando um transilluminador de acordo com o protocolo do fabricante.
- Exciso de interesse do gel e use um kit de limpeza de gel e PCR para recuperar produtos RT-PCR.
- Meça a concentração usando um espectrômetro.
NOTA: A banda purificada pode ser enviada para sequenciamento em uma empresa ou instalação de sequenciamento se nenhum equipamento de sequenciamento Sanger estiver disponível internamente. - Prepare os reagentes necessários para um kit de sequenciamento de ciclo e pipeta em uma placa PCR multiplaca de acordo com a Tabela 4. Consulte a Tabela 2 para obter sequências de primer.
- Sele a placa com filme adesivo claro.
- Vórtice a placa para 2 a 3 s. Centrifugar brevemente em uma centrífuga de balde balançando para que o conteúdo se instale na parte inferior dos poços (5 a 10 s) a 1.000 x g.
NOTA: Bolhas de ar podem estar presentes nos poços, mas não afetam negativamente a reação. - Coloque a mistura em um termociclador e execute de acordo com a Tabela 5.
- Purifique as reações de sequenciamento com placas de acordo com as instruções do fabricante.
- Use um analisador de DNA para determinar as sequências de acordo com o protocolo do fabricante.
- Compare a sequência obtida com a sequência esperada do paciente.
7. Mancha ocidental
- Preparação da amostra
- Prepare o tampão amostral SDS (4% SDS, 4 M de ureia, 10% 2-mercaptoetanol, 10% glicerol, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0,001% azul bromofenol e inibidor de protease).
- Coloque cerca de 100 fatias das seções musculares de 10 μm coletadas da crio-seção em 150 μL de tampão SDS.
- Homogeneize brevemente as amostras de proteína no gelo para 30 s usando um micro homogeneizador útil.
- Centrifugar a 16.500 x g por 15 min, e transferir o supernasal para um tubo fresco. Proceda com a análise ou armazenar a -80 °C.
- SDS-PAGE para medição de concentração de proteínas
NOTA: Uma mancha de gel fluorescente foi usada para determinar a concentração de proteínas.- Determine o peso normal da amostra de controle saudável e a concentração usando o kit de ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare as amostras para eletroforese de gel. Pipeta 10 μg de proteína total do controle saudável e 5 μL das amostras do paciente, 5 μL de tampão amostral 4x, 2 μL de agente redutor de amostra de 10x. Uma vez misturados, adicione água deionizada a um volume final de 20 μL em cada amostra.
- Aqueça amostras a 70 °C por 10 min.
- Prepare 2.000 mL de 1x SDS executando buffer usando 50 mL de 40x SDS em execução. Diluir com 1.950 mL de água deionizada.
NOTA: Neste ponto, 1.000 mL de buffer de execução é suficiente. O buffer restante de 1.000 mL é usado na etapa 7.3.1. - Misture bem e reserve 800 mL do buffer de execução 1x SDS para uso na câmara tampão inferior (externa) da caixa de gel.
- Imediatamente antes da eletroforese, adicione 500 μL de tampão antioxidante a 200 mL de 1x SDS que executa buffer para usar na câmara tampão superior (interna) da caixa de gel.
- Prepare-se para eletroforese de gel, configurando um gel de 3-8% de acetato Tris de acordo com o protocolo do fabricante. Carregue 20 μL de cada amostra no gel.
- Realize eletroforese a 150 V por 75 min.
- Após a eletroforese, coloque o gel diretamente em uma bandeja limpa contendo 50 mL de solução de mancha de gel fluorescente.
- Cubra a bandeja, coloque em um agitador e agitar sem espirrar líquido ou danificar o gel por 90 minutos.
- Transfira o gel para a água antes de fotografar em um sistema de fluorescência a iluminação de 312 nm com filtro de emissão de brometo de ethidium para detectar fluorescência.
- Meça as concentrações das amostras do paciente com base em uma curva analítica construída utilizando-se o lise de controle normal com concentração conhecida.
- SDS-PAGE para manchas ocidentais
- Prepare a caixa de gel de acordo com as etapas 7.2.4-7.2.6.
- Com base na medição de concentração obtida na etapa 7.2.11, carga 100 μg por faixa de controle saudável e 300 μg por faixa da amostra do paciente. Eletroforese usando as mesmas configurações da etapa 7.2.7.
- Transferência de proteínas
- Prepare o buffer de transferência. Mergulhe uma membrana PVDF por 20 s em metanol. Mova-o para o tampão de manchas B até usar.
- Mergulhe um papel de mancha extra-grosso no tampão de manchas A, B e C por pelo menos 30 minutos por tampão.
- Depois da eletroforese, mergulhe o gel no tampão de manchas B por 5 minutos.
- Coloque papéis de manchas, membrana PVDF e gel na máquina de transferência semi-seca de acordo com o desenho na Figura 1. Passe bolhas de ar entre o gel e a membrana com um rolo.
- Transfira a 2 mA/cm2 por 1 h no RT.
NOTA: Após a transferência, recomenda-se realizar uma mancha de proteína total semelhante à coloração de Ponceau para confirmar a transferência bem sucedida das grandes proteínas de peso molecular.
- Bloqueio e coloração de anticorpos
- Enxágüe a membrana duas vezes com PBST (1x PBS com 0,1% Tween 20).
- Coloque a membrana em 1% agente de bloqueio e balance suavemente por 1h no RT para bloquear.
- Incubar a membrana com anticorpo anti-distrofina na solução de bloqueio (1:125) e anticorpo antiespectrina (1:25.000) por 1 h na RT ou durante a noite a 4 °C.
- Lave a membrana três vezes por 10 min cada com PBST no RT.
- Incubar a membrana com peroxidase de rabanete (HRP) anticorpo anti-rato/coelho conjugado em PBST (1:100) por 40 min na RT.
- Lave a membrana novamente três vezes por 10 minutos com PBST no RT.
- Detecção
- Misturar soluções de detecção A e B em uma proporção de 1:1. O volume final de reagente de detecção necessário é de 0,1 mL/cm2 membrana.
- Remova o excesso de PBST da membrana lavada e coloque-o com o lado da proteína sobre uma folha de plástico ou outras superfícies limpas adequadas. Adicione o reagente de detecção mista na membrana e incubar por 5 minutos no RT.
- Remova o reagente de detecção em excesso segurando a membrana suavemente em fórceps e tocando a borda contra um tecido.
- Coloque o lado da proteína da mancha em uma bandeja de amostras. Opere o sistema fluorescente de acordo com a documentação do usuário. Coloque a máquina da seguinte forma. Tipo de exposição: Incremento, Intervalo: 10 s, Sensibilidade/Resolução: alta.
NOTA: As áreas medidas foram encaixotadas com um retângulo azul (Figura 4a-b): BG: fundo; D: distrofina 427 kDa, SL: isoforme longo de espectro beta (274 kDa); SS: isoform curto (253 kDa). A razão de sinal de distrofina/espectro foi calculada como (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. A proporção de controle normal foi fixada em 100%.
Representative Results
Para usar o RT-PCR para detectar o exon skipping, os primers de ambos os lados do exon que serão ignorados foram projetados e avaliados para produzir apenas bandas específicas (ver Figura 2 para um diagrama esquemático de exon skipping e posição de primer). Os primers devem gerar produtos que podem ser facilmente distinguidos pelo tamanho em um sistema MCE ou eletroforese de gel agarose normal se o MCE não estiver disponível. Figura 3a mostra sistema MCE Imagens em gel de reações RT-PCR e os resultados de sequenciamento da banda ignorada dos pacientes NS-03 e NS-07 antes e depois do tratamento com NS-065/NCNP-01 no teste de fase de escalação de dose 1. NS-03 e NS-07 docas de porto que abrangem exons 45-52 e 48-52, respectivamente. NS-03 recebeu 5 mg/kg e NS-07 20 mg/kg de NS-065/NCNP-01 semanalmente durante 12 semanas. Como esperado antes do tratamento, ambos os pacientes não mostraram falta, e apenas uma banda não ignorada poderia ser visualizada. Após 12 semanas de tratamento, uma banda baixa foi visualizada para ns-07. No entanto, ainda era difícil detectar qualquer produto ignorado para o paciente NS-03. Os resultados de sequenciamento mostraram uma concatenação dos exons 47 e 54 para ns-07, bem como os exons 44 e 54 para NS-03. De acordo com a sequência, estes poderiam teoricamente produzir uma isoforme de distrofina funcional, mas encurtada. Para calcular a porcentagem de pular mostrada na Figura 3b,a concentração molar para a banda ignorada foi dividida pela banda ignorada e não ignorada. Para o paciente NS-07, o percentual após o tratamento foi de 72%, e foi de 3,4% para O NS-03. Dados de manchas ocidentais (em triplicado) de pacientes NS-03, NS-07 e um controle saudável são mostrados na Figura 4a. Espera-se que nenhuma banda de distrofina foi detectada antes do tratamento. Após o tratamento, uma banda do paciente NS-07 foi detectada com menor peso molecular em comparação com o controle saudável (a distrofina do tipo selvagem tem um peso molecular de 427 kDa, e a distrofina NS-07 tem um peso molecular de 389 kDa). Por causa da exclusão e pular, a isoforma da distrofina do paciente NS-07 não tinha vários exons, e esperava-se que tivesse um peso molecular menor. O paciente NS-03 não mostrou níveis detectáveis de distrofina após o tratamento. Na Figura 4b,mostra-se a quantidade de distrofina em comparação com um controle saudável para o paciente NS-07. O local onde as intensidades do sinal foram medidas para o cálculo da restauração da distrofina são indicados com quadrados azuis. A razão de espectro de distrofina foi usada para calcular a quantidade de distrofina em comparação com a do controle saudável. Para isso, o sinal da distrofina menos fundo foi dividido pela soma das duas isoformas de especificação (longas e curtas) menos fundo (ver passo 8.6.5). A proporção de controle saudável foi fixada em 100%. A quantidade de distrofina em comparação com o controle saudável no paciente NS-07 após o tratamento foi de 9,1%. No entanto, o percentual não pôde ser calculado para o paciente NS-03 devido a uma faixa de distrofina fraca, semelhante à obtida para amostras de tratamento prévio para ambos os pacientes.
Figura 1: Diagrama esquemático da pilha de transferência para análise de manchas ocidentais. Montagem da pilha de transferência de manchas ocidentais com papel manchado embebido em tampão de manchas A na parte inferior seguido de papel manchado embebido em tampão de mancha B, membrana PVDF, o Gel tris-acetato de 3-8% e nos 2 papéis de mancha superiores encharcados no tampão de manchas C é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Desenho esquemático de exon pulando de exon 53 em um paciente com exon 45-52 exclusão no gene DMD. Por exemplo, o paciente NS-03 no ensaio clínico de dose-escalonamento teve essa exclusão. Se o exon 53 for mantido, o mRNA estará fora de quadro, uma vez que a junção exon-exon entre exon 44 e 53 interrompe o quadro de leitura, causando um códon de parada no exon 53. O quadro de leitura é restaurado quando o exon 53 é pulado, e uma isoforma mais curta de distrofina é produzida. Para detectar o exon 53-skipping por RT-PCR, primers em exon 44 e 54 são usados para que o produto PCR entre mRNA pulado e não ignorado possa ser facilmente detectado. FWD: primer dianteiro, REV: primer reverso, PMO: fosphorodiamidate morpholino oligomer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pulando eficiência para pacientes NS-03 e NS-07 de amostras de biópsia muscular anterior tibialis. a) Imagem em gel gerada pelo sistema de eletroforese A de amostras de RT-PCR de amostras não tratadas e tratadas de pacientes NS-03 e NS-07. O painel superior mostra ns-03 e painel inferior NS-07 em triplicado. Para ns-03, a banda não ignorada é de 422 bp, e a banda ignorada é de 212 bp. Para ns-07, as bandas são de 836 bp e 624 bp, respectivamente. A análise de sequência mostrou uma concatenação de exon 44 e exon 54 para NS-03 e exon 47 para exon 54 para NS-07. b) Pular a eficiência antes e depois do tratamento é mostrado para os pacientes NS-03 e NS-07, calculados a partir da concentração molar das duas bandas fornecidas pelo sistema A como banda pulada/(banda pulada + banda não-ignorada) x 100. A eficiência de pular para nS-03 foi muito baixa após o tratamento; para nS-07, a eficiência de pular foi de mais de 70%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação proteica de isoformas de distrofina antes e depois da terapia de exon skipping. a) Quantificação proteica de isoformas de distrofina antes e depois da terapia de exon skipping. Mancha ocidental de biópsia muscular de tibialis anterior de pacientes NS-03 e NS-07 antes e depois do tratamento e de controle saudável em triplicado. A distrofina pode ser vista a 427 kDa para o controle saudável e a 389 kDa para NS-07 após o tratamento. Nenhuma distrofina poderia ser detectada para qualquer paciente antes do tratamento, ou nenhuma poderia ser detectada após o tratamento para o paciente NS-03. A área na caixa preta é mostrada na Figura 4b. À esquerda em cada mancha o marcador é mostrado. b) A quantidade de distrofina restaurada após o tratamento para o paciente NS-07. A restauração da distrofina foi calculada com base nas intensidades das bandas para distrofina, fundo e isoforme longo e curto de espectrina de acordo com a fórmula: (distrofina - fundo)/(especificatrin L -background) + (spectrin S - fundo) onde a razão para controle saudável é definida para 100%. A intensidade de cada banda foi medida dentro das caixas azuis mostradas na figura. A restauração da distrofina para NS-07 foi de 9,1% após o tratamento. O sinal de distrofina era muito fraco para medir nas amostras não tratadas. Tamanhos de marcadores são mostrados em kilodaltons. Distrophin, BG: fundo, SL: Spectrin long isoform, SS: Spectrin short isoform, My: Myosin type 1. Tamanhos de marcadores são mostrados em kilodaltons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Volume/Reação (μl) | Concentração final |
| Água sem RNase (fornecida) | Variável | - |
| 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer | 5.0 | 1x |
| dNTP Mix (contendo 10 mM de cada dNTP) | 1.0 | 400 μM de cada dNTP |
| Primer avançado (10 μM) | 1.5 | 0,6 μM |
| Primer reverso (10 μM) | 1.5 | 0,6 μM |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Enzima Mix | 1.0 | - |
| Inibidor de RNase (opcional) | Variável | 5-10 unidades/reação |
| Modelo RNA | 50 ng | |
| Total | 25 |
Tabela 1: Reagentes RT-PCR. Os compostos necessários para uma reação do RT-PCR.
| Primer | Seqüência |
| 44F | 5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3' |
| 46F | 5'-AACCTGGAAAAAGAGCAGCAA-3' |
| 48F | 5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3' |
| 54R | 5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3' |
Tabela 2: Lista de primer. Sequências para os primers usados neste estudo. F: Para a frente, R: Reverso.
| 1 ciclo | Transcrição reversa | 30 min. | 50 °C |
| 1 ciclo | Etapa inicial de ativação do PCR | 15 min. | 95 °C |
| 35 ciclos | Desnaturação | 1 min | 94 °C |
| Recozimento | 1 min | 60 °C | |
| Extensão | 1 min | 72 °C | |
| 1 ciclo | Extensão final | 7 min. | 72 °C |
| Segurar | ∞ | 4 °C |
Tabela 3: PCR condicionado usado. Mostre as condições do PCR para a reação RT-PCR.
| Solução | Volume/Reação (μl) |
| Água sem RNase | Variável |
| Bigdye Terminator 3.1 Mix de reação pronta | 3.5 |
| Primer/Primer para frente (3.2 μM) | 2.0 |
| Modelo RNA | 20 ng |
| Total | 20 |
Tabela 4: Reagentes necessários para a reação de sequenciamento. Use o primer Forward ou Reverse na configuração, não ambos ao mesmo tempo.
| 1 ciclo | 1 min | 96 °C |
| 25 ciclos | 10 s | 96 °C |
| 5 s | 50 °C | |
| 4 min. | 60 °C | |
| Segurar | ∞ | 4 °C |
Tabela 5: Condições de PCR para o sequenciamento Sanger.
Discussion
Ensaios clínicos de DMD produziram sucessos e fracassos nos últimos anos. Tanto o RT-PCR quanto a mancha ocidental são técnicas comuns para avaliar a eficiência de pular gerada pelos compostos de exon-skipping administrados aos pacientes. No entanto, o RT-PCR foi relatado para superestimar a eficiência de pular em comparação com o PCRdigital 15. Embora isso seja devido a uma série de razões, é causado principalmente pela amplificação mais eficiente dos fragmentos pulados menores durante os ciclos de PCR. Parece que o RT-PCR usado neste ensaio clínico também gerou maior eficiência de salto em comparação com a expressão proteica estimada pela mancha ocidental. De acordo com a FDA, esta é uma maneira mais confiável de quantificar a restauração da distrofina12. Portanto, deve-se ter cuidado ao interpretar o RT-PCR ignorando os resultados; no entanto, as amostras ainda podem ser comparadas. Amostras que mostram maior eficiência de pular com base nos resultados do RT-PCR geralmente exhbitam níveis mais altos de expressão de proteína em análises de manchas ocidentais.
Como todos os pacientes em ensaios clínicos DMD não têm o mesmo padrão de exclusão, pode ser difícil projetar primers e sondas que são adequadamente específicas para realizar digital ou qPCR em todas as amostras. Portanto, o RT-PCR ainda é uma boa alternativa para uma primeira avaliação da eficiência de pular. Antes do início do ensaio clínico do NS-065/NCNP-01, foi tedioso avaliar a eficiência de pular para cada paciente in vitro, uma vez que uma biópsia muscular ou de pele era obrigatória para gerar míobios específicos do paciente. No entanto, publicamos recentemente uma nova técnica para gerar células derivadas de urina (UDCs) convertidas em MYOD1 (UDCs) como um novo modelo de célula muscular DMD16. Assim, apenas a urina coletada do paciente é necessária para gerar os mioblasts, e nenhum procedimento invasivo é necessário. Acreditamos que este método pode ser usado para tela de diferentes AONs em células específicas do paciente. Além disso, diferentes primers e sondas podem ser testados antes que o paciente inicie qualquer ensaio clínico. Isso pode facilitar o uso de qPCR ou PCR digital para medição de exon skipping em ensaios clínicos DMD no futuro.
Para a realização da análise de manchas ocidentais neste ensaio clínico, foi utilizado um único anticorpo contra a distrofina, e apenas um controle saudável foi utilizado como amostra de referência. Assim, a especificidade do anticorpo não foi validada adequadamente. Isso, juntamente com o fato de que o anticorpo reconhece apenas o domínio terminal C da distrofina, é uma limitação do protocolo. Controles e anticorpos mais saudáveis direcionados contra diferentes domínios da molécula de distrofina são aconselháveis no futuro.
Aqui, resumimos os protocolos utilizados no recente teste exploratório iniciado pelo investigador, primeiro em humano do NS-065/NCNP-01. O NS-065/NCNP-01 é potencialmente aplicável a 10,1% dos pacientes com DMD.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Somos gratos ao Dr. Takashi Saito, ao Dr. Tetsuya Nagata, ao Sr. Satoshi Masuda e ao Dr. Eri Takeshita à discussão científica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
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