Summary
Hier stellen wir die molekulare Charakterisierung der Dystrophin-38-Expression mit Sanger-Sequenzierung, RT-PCR und Western Blotting in der klinischen Studie vor.
Abstract
Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine degenerative Muskelerkrankung, die progressiven Verlust der Muskelmasse verursacht, was zum vorzeitigen Tod. Die Mutationen verursachen oft einen verzerrten Leserahmen und vorzeitige Stop-Codons, was zu einem fast vollständigen Mangel an Dystrophin-Protein führt. Der Leserahmen kann mit Antisense-Oligonukleotiden (AONs) korrigiert werden, die exon skipping induzieren. Das Morpholino AON viltolarsen (Codename: NS-065/NCNP-01) hat gezeigt, dass exon 53 überspringen, wiederdenzielle den Leserahmen für Patienten mit Exon 52 Deletionen. Wir haben kürzlich NS-065/NCNP-01 intravenös an DMD-Patienten in einer von einem explorativen Prüfarzt initiierten, ersten am Menschen initiierten Studie mit NS-065/NCNP-01 verabreicht. In diesem Methodenartikel stellen wir die molekulare Charakterisierung der Dystrophinexpression mit Sanger-Sequenzierung, RT-PCR und Western Blotting in der klinischen Studie vor. Die Charakterisierung der Dystrophin-Expression war in der Studie für den Aufzeigen der Wirksamkeit von grundlegender Bedeutung, da keine funktionellen Ergebnistests durchgeführt wurden.
Introduction
Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine degenerative Muskelerkrankung verursacht progressiven Verlust der Muskelmasse, Ateminsuffizienz, und Kardiomyopathie, und es führt zu vorzeitigem Tod1. Die Krankheit wird durch einen Mangel an dem großen strukturellen Muskelprotein Dystrophin2verursacht. Mutationen im DMD-Gen auf dem X-Chromosom sind rezessiv, und die Krankheit betrifft 1 von 3500-5000 neugeborenen Männchen3,4,5. Die Mutationen sind oft große Deletionen in einem Hotspot-Bereich zwischen exons 44 und 55, die zu einem verzerrten Leserahmen und vorzeitigen Stop-Codons führen, was zu Unsinn-vermitteltem Zerfall und einem fast vollständigen Mangel an Dystrophin-Protein6,7,8führt. Der Leserahmen kann mit Antisense-Oligonukleotiden (AONs) korrigiert werden, die Exon-Überspringen und Wiederherstellen des Leserahmens induzieren, teilweise die Dystrophinexpression wiederherstellen und das Fortschreiten der Krankheit verzögern9,10,11. Der Morpholino AON eteplirsen, der kürzlich von der Federal Drug Agency (FDA) zugelassen wurde, induziert das Überspringen von Exon 51 und kann den Leserahmen bei Patienten mit Exon 52 Deletionen12,13wiederherstellen. Exon 53 skipping stellt jedoch den Leserahmen für Patienten mit Exon 52-Deletionen wieder her und kann potenziell etwa 10% der DMD-Patienten14behandeln. Das Morpholino-AON-Medikament NS-065/NCNP-01 hat gezeigt, dass Exon 53 in menschlichen Zellen und wir haben kürzlich NS-065/NCNP-01 an DMD-Patienten in einer phase 1 offenen klinischen Phase-1-Studie zur Dosiseskalation (nachfolgend "die Studie" genannt) (registriert als UMIN: 000010964 und ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14verabreicht. Die Studie zeigte eine dosisabhängige Zunahme von Exon 53 Skipping basierend auf RT-PCR und Dystrophin-Protein-Spiegel auf der Grundlage von westlichen Blotting, und keine schweren unerwünschten Arzneimittelereignisse oder Aussetzer wurden beobachtet14.
In allen klinischen Studien ist die Analyse der Ergebnisse von größter Bedeutung. Für klinische DMD-Studien wird noch über die beste Methode diskutiert, um einen Behandlungsvorteil zu zeigen. Klinische Tests wie der 6-minütige Walk-Test haben gewisse Nachteile. Die molekulare Charakterisierung der Dystrophinexpression kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wie Z. B. RT-PCR, qPCR, Digital-PCR, Western Blotting und Immunhistochemie. Das Ausmaß der Proteinexpressionswiederherstellung, das erforderlich ist, um einen klinischen Nutzen zu erzielen, bleibt jedoch unklar. In diesem Methodenartikel beschreiben wir detailliert die RT-PCR- und Western-Blotting-Methoden, die zur Bestimmung des Exon-Skipping- bzw. Proteinspiegels in der Phase-1-Studie des AON-Überspringmedikaments NS-065/NCNP-0114verwendet werden.
Protocol
Das operative Verfahren für das von den Prüfern initiierte Verfahren wurde von der NCNP-Ethikkommission genehmigt (Genehmigungs-ID: A2013-019).
1. Vorbereitung von Muskelproben
HINWEIS: Bizeps brachii oder Quadrizeps Muskeln werden oft als Biopsie-Sites ausgewählt. Allerdings wurde das Tibialis-Vorderteil in der klinischen Studie verwendet.
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Muskelbiopsie von Patienten
- Markieren Sie die Einschnittstelle vor der Hautvorbereitung.
- Bereiten Sie die saline-gedämpfte Gaze für die Biopsieprobe vor. Drücken Sie die Gaze gut.
- Injizieren Sie lokalanästhesie in die Haut und subkutanes Gewebe, aber nicht in den Muskel. Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen von Hautschmerzen.
HINWEIS: Die Vollnarkose wird in der Regel bei pädiatrischen Patienten unter 15 Jahren angewendet. - Machen Sie einen Schnitt von der Haut zum Unterhautgewebe. Verwenden Sie kleine Retraktoren, um den Schnitt zu öffnen und das subkutane Fett zu trennen.
HINWEIS: Bei diesem Schritt kann ein Teil der Haut für die Fibroblastenkultur geschnitten werden. - Machen Sie einen weiteren kleinen Schnitt in der Faszien und schneiden Sie die Faszien weiter. Klemmen Sie die Ränder mit Mückenzangen, um den Muskel freizulegen.
- Verwenden Sie eine Naht, um den ausgewählten Teil des Muskels nach oben zu ziehen. Machen Sie einen kleinen Tunnel mit IrisSchere und setzen Sie Mückenzange in den Tunnel.
- Trennen Sie das Muskelbündel mit Zangen und schneiden Sie beide Enden des Zielteils.
HINWEIS: Muskelbiopsieproben sollten etwa die Größe eines Bleistifts für erwachsene Patienten haben (Länge 1,0-1,5 cm, Durchmesser 0,8-1,0 cm). Die Probe sollte bei pädiatrischen Patienten etwa 1 cm lang und 5 mm im Durchmesser sein. - Die Probe in eine mit Einer Wasserlinie gedämpfte Gaze wickeln und den frischen Muskel bei Raumtemperatur (RT) sofort zu einer Anlage transportieren, wo die Probe für weitere Analysen vorbereitet werden kann.
HINWEIS: Die Proben sollten bei 4 °C transportiert werden, wenn die Transportdauer 1 Stunde überschreitet.
2. Muskelprobenvorbereitung
- Mischen Sie gleiche Mengen von Tragacanth Kaugummi und Wasser, bis das Zahnfleisch weich und klebrig wird. Das Gemisch in 25 ml Spritzen geben. Die Spritzen können im Kühlschrank aufbewahrt werden.
- Legen Sie ca. 0,5 bis 1 cm Tragacanth-Kaugummi auf Korkscheiben. Beschriften Sie die Discs auf der gegenüberliegenden Seite.
- Legen Sie einen Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff, bis ein Teil der Flüssigkeit gefriert.
- Legen Sie das Exemplar in das Tragacanth-Kaugummi. Die Längsachse jedes Muskels sollte senkrecht zum Kork sein. Legen Sie Kaugummi um den Boden jedes Muskels, um die richtige Platzierung zu helfen.
- Mit einer Pinzette die Muskel-Kork-Probe in kaltes Isopentan geben, das in Schritt 2.3 zum Einfrieren vorbereitet wird. Bewegen Sie die Probe konstant für 1 min oder bis vollständig gefroren, und legen Sie auf Trockeneis vorübergehend.
- Die Probe in Glasfläschchen legen und bei -80 °C lagern.
3. Muskelschnitt
- Richten Sie den Kryostat für das Schnitten mit einer Arbeitstemperatur von -25 °C ein.
- Montieren Sie den Kork/Muskelblock und trimmen Sie, bis flache Abschnitte erreicht sind.
- Verwenden Sie eine Schnittdicke von 10 m für RT-PCR und Western Blotting. Verwenden Sie für die Immunhistochemie bzw. Hämatoxylin- bzw. Eosinfärbung eine Dicke von 6-8 m bzw. 10-12 m. In Scheiben geschnittene Abschnitte in 2,0 ml-Rohre legen und bei -80 °C für RT-PCR und Western-Blotting lagern.
4. RNA-Extraktion und Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
- Extrahieren Sie ca. 10 Scheiben mit 10 m Dicke aus gefrorenen Muskeln durch einen Kryostat. Sammeln Sie die gereinigte Gesamt-RNA mit dem Reinigungskit der gesamten RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
- Kombinieren Sie die erforderlichen Reagenzien für eine RT-PCR-Reaktion in PCR-Röhren gemäß Tabelle 1. Siehe Tabelle 2 für Primersequenzen.
HINWEIS: Die Vorwärtsgrundierung war 44F für Patienten NS-03 und 46F für Patienten NS-07. Die umgekehrte Grundierung war 54/55R als Standard. Wenn unspezifische Produkte erkennbar waren, wurde 54R als Alternative verwendet. - Legen Sie die PCR-Rohre, die das Gemisch enthalten, in einen Thermocycler. Führen Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 3aus.
- PCR-Produkt bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung oder -20 °C für Die Langzeitlagerung lagern.
5. Mikrochip-Elektrophorese und Exon-Skipping-Berechnung
HINWEIS: Ein Mikrochip-Elektrophorese-System (MCE) wird häufig ausgewählt, um die Exon-Skipping-Effizienz zu analysieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, die notwendig sind, um die Exon-Skipping-Effizienz mit einem MCE-System des Herstellers A sowie des Herstellers B, im Folgenden System A und B, zu analysieren. Während der klinischen Studie wurde die Exon-Skipping-Effizienz auf System A analysiert. System A steht jedoch nicht mehr zum Verkauf, und wir empfehlen System B, um die Exon-Skipping-Effizienz zu analysieren. Wir haben Protokolle für beide Systeme aufgenommen (siehe Abschnitt 5.1 für System A und 5.2 für System B). Siehe Tabelle der Materialien für Informationen über System A und B. Darüber hinaus kann dieser Schritt auch mit normaler Agarose-Gel-Elektrophorese durchgeführt werden, aber die Empfindlichkeit nimmt deutlich ab.
- Mikrochip-Elektrophorese mit System A
HINWEIS: System A hat zwei Arten von Chips. Hier beschreiben wir die Schritte für den DNA-Chip.- Equilibrate Kit-Reagenzien (Fleckenpuffer, Ladepuffer, Leiter und Gelpuffer) zu RT, Wirbel und Spin-down.
- Um den Gel-Fleckenpuffer (GS) vorzubereiten, fügen Sie 12,5 L Fleckenpuffer zu 250 L Gelpuffer und Wirbel für 10 s hinzu. Bewegen Sie die Lösung 15 min auf ein Spinfilterrohr und eine Zentrifuge bei 2.400 x g. Verwerfen Sie den Filter.
HINWEIS: Die gefilterte GS kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden. - Wenn proben hochkonzentriert sind, verdünnen Sie mit TE-Puffer oder DNase-freiem Wasser auf ca. 50 ng/l.
HINWEIS: Wenn Proben in einer Salzkonzentration von 200 mM KCl (oder NaCl) und/oder 15 mM MgCl2sind, tauschen Sie den Puffer aus. - Fügen Sie dem Gelgrundingbrunnen (hervorgehoben und beschriftet GS) des DNA-Chips 12 l GS-Lösung hinzu und legen Sie den Chip in die Grundierstation.
HINWEIS: Um Luftblasen zu vermeiden, legen Sie die Pipettenspitze vertikal und an den Boden des Brunnens ein, wenn Sie dosieren. Geben Sie langsam bis zum ersten Stopp an der Pipette, und nicht Luft am Ende der Pipettierstufe vertreiben. - Wählen Sie den C3-Modus und drücken Sie die Starttaste. Nachdem die Grundierung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Chip.
- Überprüfen Sie die Mikrokanäle visuell auf eingeschlossene Luftblasen oder unvollständige Grundierungen.
- Laden Sie die vorbereiteten Proben und Leiter auf den Chip wie unten.
- Pipette 9 l GS-Lösung in die anderen 3 GS-Bohrungen.
- Pipette 5 l Ladepuffer in den L-Brunnen und jede Probe gut (1-11).
- Pipette 1 l Leiter in den L-Brunnen.
- Pipette 1 l DNA-Probe in jede der 11 Probenbrunnen.
- Pipette 1 l TE oder DNase-freies Wasser in ungenutzte Brunnen. Die Kit-Schnellanleitung zeigt eine Abbildung des Chip-Layouts.
HINWEIS: Prüfen Sie alle Bohrungen auf Luftblasen, indem Sie den Chip über einem leicht farbigen Hintergrund halten. Lösen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen an der Unterseite eines Brunnens mit einer sauberen Pipettenspitze oder durch Entfernen und Nachladen der Lösung.
- Legen Sie den Chip in die Wirbelstation und drücken Sie Mix. Die Wirbelstation stoppt automatisch nach 1 min.
- Führen Sie den Chip in der Elektrophoresestation innerhalb von 5 min der Beladung.
- Wählen Sie Neue Ausführung in der Software-Symbolleiste aus. Wählen Sie auf dem Bildschirm "New Run" DNA und DNA 1K aus der Assay-Pulldown-Liste aus. Assay
- Wählen Sie entweder einen Projektordner für die Ausführung aus der Projekt-Pulldown-Liste aus, oder erstellen Sie einen neuen Projektordner, indem Sie einen Namen in das Feld Projekt eingeben. Project
- Geben Sie einen Namen für die Ausführung im Feld Ausführen von Präfix ein, und klicken Sie auf Ausführen starten.
- Das Gerät gibt einen Signalton, wenn die Analyse abgeschlossen ist, und es öffnet sich ein Fenster, das das Ende des Durchlaufs anzeigt. Wählen Sie OK und entfernen Sie den Chip von der Chip-Plattform.
- Datei auswählen | Exportieren Sie Daten, um die Daten zu exportieren. Wählen Sie die gewünschten Optionen im Exportdialog aus.
- Um die Elektroden zu reinigen, füllen Sie einen Reinigungschip mit 800 l entionisiertem Wasser und legen Sie ihn auf die Chipplattform, schließen Sie den Deckel und lassen Sie ihn für 1 min geschlossen. Nach 1 min öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie den Reinigungschip und lassen Sie die Elektroden 1 min trocknen.
- Mikrochip-Elektrophorese mit System B
- Öffnen Sie die Betriebssoftware, und geben Sie die Beispielinformationen ein. Nach Eingabe der Informationen berechnet die Software automatisch die Menge an Trennpuffer- und Markerlösungen.
- Bereiten Sie die erforderliche Menge an Trennpuffer vor, der von der Software berechnet wird. Bereiten Sie zunächst eine 100-fache Nukleinsäure-Gel-Färbung-Lösung vor, indem Sie 10.000x-Lösung mit der entsprechenden Menge an TE-Puffer verdünnen. Die 100x Lösung kann bei -20 °C gelagert werden.
- Mischen Sie eine geeignete Menge von 100x Nukleinsäure-Gel-Färbung mit Trennpuffer in der spezifischen Röhre von der Firma zur Herstellung einer 1x Lösung zur Verfügung gestellt. Wirbel die Lösung.
- Bereiten Sie die erforderliche Menge an Markerlösung im Rohr vor.
- Starten Sie das Sondenwaschprogramm.
- Starten Sie das Mikrochip-Waschprogramm, wenn Sie fertig sind.
- Gleichzeitig pipette die Proben zu einer PCR-Multiplatte (96-gut, klar) und verdünnen 4 mal mit entionisiertem Wasser. Das minimale Volumen, das die Maschine verarbeiten kann, beträgt 6 l, und das Maximum beträgt 30 l. Wir schlagen ein Gesamtvolumen von 10 l (2,5 l Probe und 7,5 l Wasser/TE-Puffer) vor.
- Bedecken Sie die Platten mit klebenden PCR-Dichtungsfolienplatten und spinnen Sie die Proben aus.
- Stellen Sie die Platte, die Markerlösung und den 1x-Trennpuffer in der Maschine entsprechend der von der Maschine angezeigten Platzierung ein. Drücken Sie die Starttaste.
- Wenn der Lauf abgeschlossen ist, exportieren Sie die Ergebnisdaten als .csv-Datei aus der Software und berechnen Sie die Exon-Skipping-Effizienz mit Molkonzentration wie folgt:
Exon-Skipping-Effizienz (%) = (Übersprungband / (Übersprungband + Nicht übersprungenes Band) X 100
6. Komplementäre DNA (cDNA) Sequenzierung
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Agarose-Gel-Präparat
- 1,5 g Agarosepulver messen und das Pulver mit 100 ml 1x TAE-Puffer in einem mikrowavablen Kolben mischen (was zu einem 1,5% Agarose-Gel führt).
- Mikrowelle für 1-3 min, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
HINWEIS: Überkochen Sie die Lösung nicht, da ein Teil des Puffers verdunstet und den endgültigen Agarose-Anteil des Gels verändert. - Lassen Sie die Agarose-Lösung auf ca. 50 °C abkühlen.
- Fügen Sie der Agaroselösung 10 l 10.000x fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff hinzu.
- Gießen Sie die Agarose in ein Geltablett mit dem Brunnenkamm an Ort und Stelle. Lassen Sie bei RT für 20-30 min, bis es vollständig verfestigt hat.
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Sequenzierung
- Mischen Sie 5 l RT-PCR-Produkt (ab Schritt 4.4) und 1 l 6x Ladepuffer. Laden Sie sie in die Brunnen des 1,5% Agarose Gel.
- Führen Sie das Gel bei 135 V für 5 min und 120 V für 20 min.
- Visualisieren Sie die Bänder mit einem Transilluminator gemäß dem Herstellerprotokoll.
- Verbrauchen Sie Bänder von Interesse aus dem Gel und verwenden Sie ein Gel und PCR Cleanup Kit, um RT-PCR-Produkte abzurufen.
- Messen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer.
HINWEIS: Das gereinigte Band kann zur Sequenzierung in einem Unternehmen oder einer Sequenzierungseinrichtung gesendet werden, wenn keine Sanger-Sequenzierungsausrüstung im eigenen Haus verfügbar ist. - Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien für ein Zyklussequenzierungskit und eine Pipette in eine multiplate PCR-Platte gemäß Tabelle 4vor. Siehe Tabelle 2 für Primersequenzen.
- Versiegeln Sie die Platte mit einem klaren Klebefilm.
- Wirbel die Platte für 2 bis 3 s. Zentrifugieren Sie kurz in einer schwingenden Eimerzentrifuge, so dass sich der Inhalt bei 1.000 x gauf den Boden der Brunnen (5 bis 10 s) absetzt.
HINWEIS: Luftblasen können in den Brunnen vorhanden sein, aber sie beeinflussen die Reaktion nicht negativ. - Die Mischung in einen Thermocycler geben und nach Tabelle 5laufen lassen.
- Reinigen Sie die Sequenzierungsreaktionen mit Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie einen DNA-Analysator, um die Sequenzen gemäß dem Herstellerprotokoll zu bestimmen.
- Vergleichen Sie die erhaltene Sequenz mit der erwarteten Sequenz des Patienten.
7. Western Blotting
- Probenvorbereitung
- SDS-Probenpuffer (4% SDS, 4 M Harnstoff, 10% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 70 mM Tris-HCl pH 6,4, 0,001% Bromphenolblau und Proteasehemmer) vorbereiten.
- Legen Sie etwa 100 Scheiben der 10 m Muskelabschnitte, die aus Kryo-Sektionen gesammelt wurden, in 150 l SDS-Puffer.
- Die Proteinproben auf Eis für 30 s mit einem handlichen Mikrohomogenisator kurz homogenisieren.
- Zentrifugieren Sie bei 16.500 x g für 15 min und übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr. Fahren Sie mit der Analyse fort oder lagern Sie sie bei -80 °C.
- SDS-PAGE zur Messung der Proteinkonzentration
HINWEIS: Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde ein fluoreszierender Gelfleck verwendet.- Bestimmen Sie das normale gesunde Kontrollprobengewicht und die Konzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Sie die Proben für die Gelelektrophorese vor. Pipette 10 g Gesamtprotein der gesunden Kontrolle und 5 l der Patientenproben, 5 l 4x Probenpuffer, 2 l 10x Probenreduktionsmittel. Nachdem diese gemischt wurden, fügen Sie deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 20 l in jeder Probe hinzu.
- Wärmeproben bei 70 °C für 10 min.
- Bereiten Sie 2.000 ml 1x SDS-Laufpuffer mit 50 ml 40x SDS-Laufpuffer vor. Mit 1.950 ml entionisiertem Wasser verdünnen.
HINWEIS: An diesem Punkt reichen 1.000 ml laufender Puffer aus. Der verbleibende 1.000 ml Puffer wird bei Schritt 7.3.1 verwendet. - Mischen Sie gründlich und legen Sie 800 ml des 1x SDS Laufpuffers für den Einsatz in der unteren (äußeren) Pufferkammer der Gelbox beiseite.
- Unmittelbar vor der Elektrophorese 500 l Antioxidanspuffer zu 200 ml 1x SDS-Laufpuffer hinzufügen, um sie in der oberen (inneren) Pufferkammer der Gelbox zu verwenden.
- Bereiten Sie sich auf die Gelelektrophorese vor, indem Sie ein 3-8% Tris-Acetat-Gel gemäß dem Herstellerprotokoll einrichten. Tragen Sie 20 l jeder Probe auf das Gel.
- Elektrophorese bei 150 V für 75 min durchführen.
- Nach der Elektrophorese das Gel direkt in eine saubere Schale geben, die 50 ml fluoreszierende Gel-Fleckenlösung enthält.
- Bedecken Sie das Tablett, legen Sie es auf einen Shaker und rühren Sie sich, ohne Flüssigkeit zu spritzen oder das Gel 90 min zu beschädigen.
- Übertragen Sie das Gel in Wasser, bevor Esin einem Fluoreszenzsystem bei 312 nm Beleuchtung mit Ethidiumbromid-Emissionsfilter gezitigt wird, um Fluoreszenz zu erkennen.
- Messen Sie die Konzentrationen der Patientenproben auf der Grundlage einer analytischen Kurve, die mit dem normalen Kontrolllysat mit bekannter Konzentration erstellt wurde.
- SDS-PAGE für Western Blotting
- Bereiten Sie die Gelbox gemäß den Schritten 7.2.4-7.2.6 vor.
- Basierend auf der in Schritt 7.2.11 durchgeführten Konzentrationsmessung werden 100 g pro Spur gesundes Kontrolllysat und 300 g pro Spur der Patientenprobe geladen. Elektrophorese mit den gleichen Einstellungen wie Schritt 7.2.7.
- Proteintransfer
- Bereiten Sie den Übertragungspuffer vor. Einweichen Sie eine PVDF-Membran für 20 s Methanol. Verschieben Sie es in den Blotting-Puffer B, bis es verwendet wird.
- Ein extra dickes Blotting-Papier im Fleckpuffer A, B und C für mindestens 30 min pro Puffer einweichen.
- Nach der Elektrophorese das Gel im Fleckpuffer B 5 min einweichen.
- Blottingpapiere, PVDF-Membran und Gel gemäß der Zeichnung in Abbildung 1auf die halbtrockene Transfermaschine legen. Luftblasen zwischen Gel und Membran mit einer Walze ausrollen.
- Transfer bei 2 mA/cm2 Membran für 1 h bei RT.
HINWEIS: Nach der Übertragung wird empfohlen, einen Gesamtproteinfleck ähnlich der Ponceau-Färbung durchzuführen, um eine erfolgreiche Übertragung der großmolekularen Proteine zu bestätigen.
- Blockierung und Antikörperfärbung
- Spülen Sie die Membran zweimal mit PBST (1x PBS mit 0,1% Tween 20).
- Legen Sie die Membran in 1% Blockiermittel, und Schaukel sanft für 1 h bei RT zu blockieren.
- Inkubieren Sie die Membran mit Antidystrophin-Antikörper in Blockierlösung (1:125) und Anti-Spektrin-Antikörper (1:25.000) für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 min mit PBST bei RT.
- Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte sekundäre Anti-Maus/Kaninchen-Antikörper in PBST (1:100) für 40 min bei RT.
- Waschen Sie die Membran erneut dreimal für 10 min mit PBST bei RT.
- Erkennung
- Mix-Erkennungslösungen A und B im Verhältnis 1:1. Das letzte benötigte Volumen des Detektionsreagenzes beträgt 0,1ml/cm2 Membran.
- Entfernen Sie den überschüssigen PBST von der gewaschenen Membran und legen Sie ihn mit der Proteinseite auf eine Folie aus Kunststofffolie oder anderen geeigneten sauberen Oberflächen. Fügen Sie das gemischte Detektionsreagenz auf die Membran und inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT.
- Entfernen Sie das überschüssige Detektionsreagenz, indem Sie die Membran sanft in die Zange halten und die Kante gegen ein Gewebe berühren.
- Legen Sie die Fleckproteinseite auf eine Probeschale. Betreiben Sie das Fluoreszenzsystem gemäß der Benutzerdokumentation. Stellen Sie die Maschine wie folgt ein. Belichtungstyp: Inkrement, Intervallzeit: 10 s, Empfindlichkeit/Auflösung: hoch.
ANMERKUNG: Die gemessenen Bereiche wurden mit einem blauen Rechteck geschachtelt(Abbildung 4a-b): BG: Hintergrund; D: Dystrophin 427 kDa, SL: Spectrin beta long isoform (274 kDa); SS: kurzes Isoform (253 kDa). Das Dystrophin/Spectrin-Signalverhältnis wurde als (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)] berechnet. Das Verhältnis der normalen Steuerung wurde auf 100% festgelegt.
Representative Results
Um RT-PCR zum Erkennen von Exon-Skipping zu verwenden, wurden Primer auf beiden Seiten des Exons, die übersprungen werden, so konzipiert und ausgewertet, dass nur bestimmte Bänder ergeben (siehe Abbildung 2 für ein schematisches Diagramm des Exon-Springens und der Primer-Position). Die Primer sollten Produkte erzeugen, die leicht nach Größe auf einem MCE-System oder normaler Agarose-Gel-Elektrophorese unterschieden werden können, wenn MCE nicht verfügbar ist. Abbildung 3a zeigt MCE-System A-Gel-Bilder von RT-PCR-Reaktionen und die Sequenzierungsergebnisse des übersprungenen Bandes von den Patienten NS-03 und NS-07 vor und nach der Behandlung mit NS-065/NCNP-01 in der Dosis-Eskalationsphase 1-Studie. NS-03 und NS-07 beherbergen Löschungen, die die Exons 45-52 bzw. 48-52 umfassen. NS-03 erhielt 5 mg/kg und NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 wöchentlich für 12 Wochen. Wie vor der Behandlung erwartet, zeigten beide Patienten kein Überspringen, und nur ein nicht übersprungenes Band konnte visualisiert werden. Nach 12 Wochen Behandlung wurde für NS-07 ein deutlich übersprungenes unteres Band visualisiert. Es war jedoch immer noch schwierig, ein übersprungenes Produkt für Patienten NS-03 zu erkennen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten eine Verkettung der Exons 47 und 54 für NS-07 sowie der Exons 44 und 54 für NS-03. Je nach Sequenz könnten diese theoretisch eine funktionelle, aber verkürzte Dystrophin-Isoform erzeugen. Um den in Abbildung 3bdargestellten Überspringprozentsatz zu berechnen, wurde die Molkonzentration für das übersprungene Band durch das übersprungene und das nicht übersprungene Band geteilt. Bei Patient NS-07 betrug der Prozentsatz nach der Behandlung 72 % und für NS-03 3,4 %. Westliche Blotdaten (in dreifacher Ausfertigung) von Patienten NS-03, NS-07 und eine gesunde Kontrolle sind in Abbildung 4adargestellt. Voraussichtlich wurde vor der Behandlung kein Dystrophinband nachgewiesen. Nach der Behandlung wurde ein Band des Patienten NS-07 mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle nachgewiesen (Wildtyp Dystrophin hat ein Molekulargewicht von 427 kDa, und NS-07 Dystrophin hat ein Molekulargewicht von 389 kDa). Aufgrund der Exon-Deletion und des Überspringens fehlte der Dystrophin-Isoform des Patienten NS-07 mehrere Exons, und es wurde erwartet, dass sie ein geringeres Molekulargewicht haben würde. Patient NS-03 zeigte nach der Behandlung keine nachweisbaren Dystrophinspiegel. In Abbildung 4bwird die Menge an Dystrophin im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle für Den Patienten NS-07 angezeigt. Die Stelle, an der Signalintensitäten für die Berechnung der Dystrophin-Restauration gemessen wurden, wird mit blauen Quadraten angezeigt. Das Dystrophin-Spektrin-Verhältnis wurde verwendet, um die Menge an Dystrophin im Vergleich zu der der gesunden Kontrolle zu berechnen. Zu diesem Zweck wurde das Signal aus dem Dystrophin minus Hintergrund durch die Summe der beiden Spektrinisoformen (lang und kurz) minus Hintergrund geteilt (siehe Schritt 8.6.5). Das Verhältnis für eine gesunde Kontrolle wurde auf 100% festgelegt. Die Menge an Dystrophin im Vergleich zur gesunden Kontrolle bei Patient NS-07 nach der Behandlung betrug 9,1%. Der Prozentsatz konnte jedoch für den Patienten NS-03 aufgrund eines schwachen Dystrophinbandes, das ähnlich dem für frühere Behandlungsproben beider Patienten erhalten wurde, nicht berechnet werden.
Abbildung 1: Schematisches Diagramm des Übertragungsstapels für die Western-Blot-Analyse. Montage des Western Blot Transfer Stacks mit Blotting-Papier, das in Blotting-Puffer A im Boden eingeweicht ist, gefolgt von Blotting-Papier, das in Blotting-Puffer B, PVDF-Membran, dem 3-8% Tris-Acetat-Gel und auf den oberen 2 Blotting-Papieren, die in Fleckpuffer C eingeweicht sind, gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Zeichnung des Exon-Überspringens von Exon 53 bei einem Patienten mit Exon 45-52-Deletion im DMD-Gen. Zum Beispiel, Patient NS-03 in der Dosis-Eskalation klinischen Studie hatte diese Deletion. Wenn exon 53 beibehalten wird, ist die mRNA aus dem Rahmen, da die Exon-Exon-Kreuzung zwischen exon 44 und 53 den Leserahmen stört, was zu einem Stop-Codon in exon 53 führt. Der Leserahmen wird wiederhergestellt, wenn exon 53 übersprungen wird und eine kürzere Isoform von Dystrophin erzeugt wird. Um exon 53-skipping per RT-PCR zu erkennen, werden Primer in exon 44 und 54 verwendet, so dass das PCR-Produkt zwischen übersprungener und nicht übersprungener mRNA leicht erkannt werden kann. FWD: Vorwärtsgrundierung, REV: Reverse Primer, PMO: Phosphorodiamid-Morpholino-Oligomer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Überspringen der Effizienz für Patienten NS-03 und NS-07 aus tibialis vorderen Muskelbiopsieproben. a) Gelbild, das durch das Elektrophoresesystem A von RT-PCR-Proben unbehandelter und behandelter Proben der Patienten NS-03 und NS-07 erzeugt wird. Das obere Panel zeigt NS-03 und das untere Panel NS-07 in Dreifachausführung. Bei NS-03 beträgt das nicht übersprungene Band 422 bp und das übersprungene Band 212 bp. Für NS-07 sind die Bänder 836 bp bzw. 624 bp. Die Sequenzanalyse ergab eine Verkettung von Exon 44 und Exon 54 für NS-03 und exon 47 zu exon 54 für NS-07. b) Für die Patienten NS-03 und NS-07 wird die Effizienz vor und nach der Behandlung übersprungen, berechnet aus der Molkonzentration der beiden vom System A bereitgestellten Bänder als übersprungenes Band/(übersprungenes Band + nicht übersprungenes Band) x 100. Die Überspringwirkung für NS-03 war nach der Behandlung sehr gering; für NS-07 betrug die Übersprungeffizienz über 70%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Proteinquantifizierung von Dystrophin-Isoformen vor und nach der Exon-Skipping-Therapie. a) Proteinquantifizierung von Dystrophin-Isoformen vor und nach der Exon-Skipping-Therapie. Western Blot der Muskelbiopsie von tibialis anterior von den Patienten NS-03 und NS-07 vor und nach der Behandlung und von gesunder Kontrolle in Triplicate. Dystrophin kann bei 427 kDa für die gesunde Kontrolle und bei 389 kDa für NS-07 nach der Behandlung gesehen werden. Für den Patienten vor der Behandlung konnte weder Dystrophin noch nach der Behandlung des Patienten NS-03 dys nachgewiesen werden. Der Bereich in der Blackbox ist in Abbildung 4bdargestellt. Links in jedem Fleck wird der Marker angezeigt. b) Die Menge an Dystrophin, die nach der Behandlung des Patienten NS-07 wiederhergestellt wurde. Dystrophin-Wiederherstellung wurde basierend auf den Intensitäten der Bänder für Dystrophin, Hintergrund und die lange und kurze Isoform von Spectrin nach der Formel berechnet: (Dystrophin - Hintergrund)/(spectrin L -background) + (spectrin S - Hintergrund), wo das Verhältnis für eine gesunde Kontrolle auf 100% eingestellt ist. Die Intensität jedes Bandes wurde in den blauen Boxen gemessen, die in der Abbildung dargestellt sind. Die Dystrophin-Restauration für NS-07 betrug nach der Behandlung 9,1%. Das Dystrophinsignal war zu schwach, um es in den unbehandelten Proben messen zu können. Markergrößen werden in Kilodaltons dargestellt. Dys: Dystrophin, BG: Hintergrund, SL: Spectrin long isoform, SS: Spectrin short isoform, My: Myosin type 1. Markergrößen werden in Kilodaltons dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Volumen/Reaktion (l) | Endgültige Konzentration |
| RNasefreies Wasser (im Vorzeichen) | Variable | - |
| 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Puffer | 5.0 | 1x |
| dNTP Mix (enthält 10 mM jedes dNTP) | 1.0 | 400 m von jedem dNTP |
| Vorwärts-Primer (10 m) | 1.5 | 0,6 m |
| Reverse Primer (10 'M) | 1.5 | 0,6 m |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Enzymmix | 1.0 | - |
| RNase-Inhibitor (optional) | Variable | 5–10 Einheiten/Reaktion |
| Template-RNA | 50 ng | |
| gesamt | 25 |
Tabelle 1: RT-PCR-Reagenzien. Die notwendigen Verbindungen für eine Reaktion der RT-PCR.
| Primer | Sequenz |
| 44F | 5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3' |
| 46F | 5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3' |
| 48F | 5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-TCTCTCTCTCACTCACCCTTTT-3' |
| 54R | 5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3' |
Tabelle 2: Primerliste. Sequenzen für die in dieser Studie verwendeten Primer. F: Vorwärts, R: Rückwärts.
| 1 Zyklus | Umgekehrte Transkription | 30 Min. | 50 °C |
| 1 Zyklus | Erster PCR-Aktivierungsschritt | 15 Min. | 95 °C |
| 35 Zyklen | Denaturierung | 1 Min. | 94 °C |
| Glühen | 1 Min. | 60 °C | |
| Erweiterung | 1 Min. | 72 °C | |
| 1 Zyklus | Endgültige Verlängerung | 7 Min. | 72 °C |
| Halten | ∞ | 4 °C |
Tabelle 3: PCR-Konditioniert verwendet. PCR-Bedingungen für die RT-PCR-Reaktion anzeigen.
| Lösung | Volumen/Reaktion (l) |
| RNasefreies Wasser | Variable |
| BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix | 3.5 |
| Vorwärts-Primer/Reverse Primer (3,2 m) | 2.0 |
| Template-RNA | 20 ng |
| gesamt | 20 |
Tabelle 4: Reagenzien, die für die Sequenzierungsreaktion erforderlich sind. Verwenden Sie entweder Vorwärts- oder Rückwärtsgrundierung im Setup, nicht beide gleichzeitig.
| 1 Zyklus | 1 Min. | 96 °C |
| 25 Zyklen | 10 s | 96 °C |
| 5 s | 50 °C | |
| 4 Min. | 60 °C | |
| Halten | ∞ | 4 °C |
Tabelle 5: PCR-Bedingungen für die Sanger-Sequenzierung.
Discussion
Klinische Studien mit DMD haben in den letzten Jahren sowohl Erfolge als auch Misserfolge hervorgebracht. Sowohl RT-PCR als auch Western Blotting sind gängige Techniken zur Beurteilung der Überspringeffizienz, die durch Exon-Skipping-Verbindungen erzeugt wird, die den Patienten verabreicht werden. Es wurde jedoch berichtet, dass RT-PCR die Übersprungseffizienz im Vergleich zu digitaler PCR15überschätzt. Obwohl dies auf eine Reihe von Gründen zurückzuführen ist, wird es in erster Linie durch die effizientere Verstärkung der kleineren übersprungenen Fragmente während PCR-Zyklen verursacht. Es scheint, dass RT-PCR in dieser klinischen Studie verwendet auch höhere Überspringwirkung im Vergleich zu der Proteinexpression durch Western Blotting geschätzt erzeugt. Nach Angaben der FDA, Dies ist ein zuverlässiger Weg, um Dystrophin-Restauration zu quantifizieren12. Daher ist Vorsicht geboten, wenn die Ergebnisse von RT-PCR übersprungen werden; Die Proben können jedoch noch verglichen werden. Proben mit höheren Sprungeffizienzen auf basis der RT-PCR-Ergebnisse exhbit höhere Proteinexpressionsniveaus in westlichen Blot-Analysen.
Da alle Patienten in klinischen DMD-Studien nicht das gleiche Deletionsmuster aufweisen, kann es schwierig sein, Primer und Sonden zu entwerfen, die für die Durchführung digitaler oder qPCR-Tests auf allen Proben ausreichend spezifisch sind. Daher ist RT-PCR immer noch eine gute Alternative für eine erste Bewertung der Überspringeffizienz. Bevor die klinische Studie mit NS-065/NCNP-01 begann, war es mühsam, die Übersprungseffizienz für jeden Patienten in vitro zu bewerten, da entweder eine Muskel- oder Hautbiopsie obligatorisch war, um patientenspezifische Myoblasten zu erzeugen. Jedoch haben wir vor kurzem eine neuartige Technik veröffentlicht, um patientenspezifische MYOD1-konvertierte, urinabgeleitete Zellen (UDCs) als neuartiges DMD-Muskelzellmodell16zu generieren. Daher ist nur Urin vom Patienten gesammelt erforderlich, um die Myoblasten zu erzeugen, und kein invasives Verfahren ist notwendig. Wir glauben, dass diese Methode verwendet werden kann, um verschiedene AONs in patientenspezifischen Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus können verschiedene Primer und Sonden getestet werden, bevor der Patient eine klinische Studie beginnt. Dies kann den Einsatz von qPCR oder digitaler PCR für Exon-Skipping-Messungen in klinischen DMD-Studien in der Zukunft erleichtern.
Für die Durchführung der Western Blot-Analyse in dieser klinischen Studie wurde ein einziger Antikörper gegen Dystrophin verwendet, und nur eine gesunde Kontrolle wurde als Referenzprobe verwendet. Daher wurde die Spezifität des Antikörpers nicht angemessen validiert. Dies, zusammen mit der Tatsache, dass der Antikörper nur die C-Terminal-Domäne von Dystrophin erkennt, ist eine Einschränkung des Protokolls. Gesündere Kontrollen und Antikörper, die gegen verschiedene Bereiche des Dystrophinmoleküls gerichtet sind, sind in Zukunft ratsam.
Hier haben wir die Protokolle zusammengefasst, die in der jüngsten von Densaim initiierten, ersten studierten Studie mit NS-065/NCNP-01 verwendet wurden. NS-065/NCNP-01 ist potenziell für 10,1 % der Patienten mit DMD anwendbar.
Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Takashi Saito, Dr. Tetsuya Nagata, Herrn Satoshi Masuda und Dr. Eri Takeshita für die wissenschaftliche Diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
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