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Immunology and Infection

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60693
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Abstract

Il sistema di secrezione Dot/Icm della Legionella pneumophila è una nanomacchina complessa di secrezione IV (T4SS) che localizza al polo batterico e media la somministrazione di substrati proteici e del DNA alle cellule bersaglio, un processo che generalmente richiede un contatto diretto tra cellule. Recentemente abbiamo risolto la struttura dell'apparato Punto/Icm mediante tomografia crioelettronica (cryo-ET) e dimostrato che forma un canale di involucro cellulare che si collega a un complesso citoplasmatico. L'applicazione di due approcci complementari che preservano la struttura nativa dell'esemplare, la microscopia fluorescente nelle cellule viventi e il crio-ET, consente la visualizzazione in situ delle proteine e l'assimilazione della stoichiometria e la tempistica della produzione di ciascuna componente macchina rispetto ad altre sottounità punto/icm. Per studiare i requisiti per il posizionamento polare e caratterizzare le caratteristiche dinamiche associate alla biogenesi della macchina T4SS, abbiamo fuso una proteina fluorescente verde di codifica genica ai geni AtPase di Dot/Icm nelle loro posizioni native sul cromosoma. Il seguente metodo integra la microscopia quantitativa a fluorescenza delle cellule viventi e il crio-ET per quantificare la localizzazione, la dinamica e la struttura polari di queste proteine nelle cellule batteriche intatte. L'applicazione di questi approcci per lo studio della Legionella pneumophila T4SS è utile per caratterizzare la funzione del sistema Dot/Icm e può essere adattata per studiare un'ampia varietà di patogeni batterici che utilizzano il T4SS o altri tipi di complessidi di secrezione batterica.

Introduction

La legionella pneumophila (L. pneumophila), l'agente eziologico della malattia dei Legionari, abita serbatoi d'acqua dolce, dove i batteri si propagano infettando e replicandoalli protozoi acquatici di nuoto libero. L. pneumophila provoca focolai di malattia nell'uomo quando si verifica l'inalazione di batteri aerosolizzati da fonti di acqua potabile. Nelle cellule infette, la sovversione delle vie ospiti consente a L. pneumophila di ritardare la maturazione endocitica del vacuolo in cui risiede e di promuovere la biogenesi di un compartimento cellulare che supporta la replicazione batterica. Questo processo è guidato da un sistema di secrezione iVB di tipo batterico specializzato (T4BSS) noto come Punto/Icm e dal suo repertorio di oltre 300 proteine "effettore" che vengono traslocate nel citosol ospite durante l'infezione per facilitare la manipolazione delle funzioni cellulari1,2,3,4. I mutanti privi di un apparato funzionale Dot/Icm non riescono a fornire gli effettisori nel citosol ospite, sono difettosi per la replicazione intracellulare e sono avirulenti nei modelli animali della malattia6,7.

Molte specie batteriche hanno sviluppato macchine multicomponente estremamente complesse e dinamiche che sono necessarie per i processi di infezione. Altri T4BSS come il sistema Dot/Icm sono essenziali anche per la replicazione intracellulare di patogeni batterici come Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Sebbene i T4BSS siano evolutivamente correlati a sistemi prototipici di IVA di tipo, che mediano il trasferimento del DNA e possono fornire un repertorio limitato di proteine efvigoreri, il sistema Dot/Icm ha quasi il doppio dei componenti della macchina e offre un'ampia varietà di eseguzioni. Presumibilmente, questa espansione del numero di componenti ha permesso all'apparato Punto/Icm di ospitare e integrare facilmente nuovi effaranti8,9.

Recentemente abbiamo usato la tomografia crioelettronica (crio-ET) per risolvere la struttura dell'apparato Punto/Icm in situ e abbiamo dimostrato che forma un canale di involucro cellulare che si collega a un complesso citoplastico. Ulteriori analisi hanno rivelato che il citosolico ATPase DotB si associa al sistema Dot/Icm al polo cellulare L. pneumophila attraverso interazioni con il citosolico ATPase DotO. Abbiamo scoperto che DotB mostra un movimento citosolico nella maggior parte delle cellule batteriche, indicando che questo ATPase è presente in una popolazione citosolica dinamica, ma si associa anche ai complessi polari Dot/Icm. Inoltre, DotO forma un assemblaggio hexameric di dimeri DotO associati al complesso della membrana interna, e un esamemerDot si unisce alla base di questo complesso citoplasmatico. L'assemblaggio del complesso energetico DotB-DotO crea un canale citoplasmico che dirige la traslocazione dei substrati attraverso il T4SS (Figura 1)10.

Nonostante questi recenti progressi, si sa poco su come funziona il sistema Dot/Icm e su come ogni proteina si assembla per formare un apparato attivo8. Scoprire i circuiti regolatori del Dot/Icm T4SS è fondamentale per comprendere i meccanismi molecolari delle interazioni host-patogen. Pertanto, discutiamo come utilizzare la microscopia a cellule vive e il crio-ET per rilevare e caratterizzare i componenti essenziali del sistema L. pneumophila Dot/Icm che sono contrassegnati con GFP super-folder (sfGFP). Utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza, la localizzazione polare di DotB sarà definita in uno sfondo di tipo selvaggio o quando il sistema di tipo IV viene eliminato. La microscopia time-lapse sarà utilizzata per quantificare le differenze nella localizzazione e nella dinamica tra l'ATPases citosolico Dot/Icm.

L'applicazione combinata di due approcci complementari come l'imaging dal vivo e il crio-ET offre un vantaggio rispetto ad altri sistemi in vitro. Entrambi i metodi vengono eseguiti in celle intatte e preservano l'ambiente naturale del T4BSS, riducendo così al minimo l'interruzione della struttura nativa durante la preparazione del campione. Poiché la sovraespressione delle proteine può compromettere la stoichiometria dell'apparato di secrezione, le fusioni sfGFP vengono restituite attraverso lo scambio allelico al cromosoma Legionella in modo che ogni fusione sia codificata in una singola copia e l'espressione sia guidata dal promotore endogeno. La visualizzazione di fusioni cromosomiche con codifica consente la quantificazione dell'esatto livello di proteina espresso in un momento definito. Cryo-ET ha anche molti vantaggi per determinare la struttura dei sistemi di secrezione. Il vantaggio più notevole è che i campioni di crio-ET sono costituiti da cellule intatte congelate che conservano complessi nativi nel contesto dell'architettura delle cellule batteriche. Di conseguenza, il crio-ET può essere preferibile agli approcci di purificazione biochimica, che estraggono complessi di membrana e possono privare le proteine periferiche dall'apparato centrale o modificare la struttura complessiva. Inoltre, etichettare una proteina di interesse con una proteina ingombrante come sfGFP aggiunge una massa rilevabile dal crio-ET e può aiutare a mappare i diversi sottocomplessi dell'apparato Punto/Icm sulla struttura ottenuta da cryo-ET.

Questo approccio è un potente strumento per scoprire informazioni strutturali sui complessi multimolecolari che si assemblano nella membrana cellulare batterica. L'interpretazione delle strutture chiarite utilizzando queste tecniche aiuterà il campo a capire come funzionano i componenti T4BSS, perché così tanti componenti sono necessari per la funzione, come i componenti interagiscono all'interno del complesso maggiore e quali funzioni questi i sottoassiemi vengono eseguiti.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure che comportano la crescita, la manipolazione e l'imaging di L. pneumophila devono essere eseguite in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2 in conformità con le linee guida locali.

1. Inserimento di sfGFP in L. pneumophila Cromosoma utilizzando Lo scambio allelico e doppia strategia di selezione (Figura 2, Figura 3)

  1. Clone nel vettore di sostituzione genica pSR47S11 la seguente sequenza: l'a monte di 1.000 bp del sito di interesse, quindi la sequenza sfGFP, quindi i 1.000 bp a valle del sito di interesse (Figura 2). La sequenza sfGFP deve essere inserita nel frame del capon o del capoC termina con un linker che contiene da quattro a otto aminoacidi. Trasformare il vettore risultante in E. coli DH5- pir. Più tardi, striscia L. pneumophila (il destinatario) per singole colonie su estratto di carbone-lievito (CYE) agar12 contenente 100 g/mL streptomicina e crescere per 5 giorni a 37 gradi centigradi(Figura 3).
  2. Streak L. pneumophila su CYE-agar-streptomycin e crescere per 2 giorni a 37 gradi centigradi (patch pesante)10. Streak E. coli DH5 è stata trasformata con pRK600 helper plasmid (helper)13 sull'agar LB contenente 25 g/mL di clorammidenico. Streak l'E. coli DH5-pir (donatore) sull'agar LB contenente 50 g/mL di kanamicine.
  3. Eseguire l'accoppiamento triparentale: incubare una colonia dell'aiutante, una colonia del donatore e il destinatario sovrapponendo le patch dei tre ceppi su una piastra di agar CYE senza selezione e incubare per 4-8 h a 37 gradi centigradi. Come controlli negativi incubare un aiutante- miscela di deformazione ricevente e un mix di deformazione donatore-ricevente per gli stessi periodi di tempo.
  4. Risospendere le reazioni di accoppiamento in 500 gradi l di ddH2O. Piastra 20 e 50 l delle reazioni sull'agar CYE contenente 100 streptomici e 10g/mL di kanamycin e crescere per 5 giorni a 37 . Streak quattro dei cloni risultanti sull'agar CYE contenenti 100 g/mL di streptomicina e crescono per 5 giorni a 37 gradi centigradi.
  5. Streak 16 cloni su agar CYE contenente 5% di saccarosio e 100 g/mL di streptomicina e crescono per 5 giorni a 37 gradi centigradi. Poi, striscia 32 di questi cloni su agar CYE contenente 100 g/mL streptomicina e su agar CYE contenente 100 streptomici e 10 g /mL di kanamycin e crescere per 5 giorni a 37 .

2. Isolamento dei cloni integrati sfGFP nel cromosoma L. pneumophila

  1. Cloni Streak sensibili alla kanamicicina su piastre CYE-agar-streptomicine e confermano l'inserimento di sfGFP nel cromosoma con colonia PCR. Utilizzare primer complementari al gene sfGFP e alla regione cromosomica di interesse per amplificare la giunzione di inserimento.
    1. Mescolare 0,5 l l di ciascuna delle soluzioni da 10 m e una colonia ad un volume finale di 12,5 gradi centigradi e denaturare per 10 min a 95 gradi centigradi. Raffreddare sul ghiaccio per 10 min, aggiungere 12,5 litri di 2x soluzione di miscela master PCR ed eseguire un'analisi PCR.
  2. Coltiva pesanti chiazze delle colonie isolate su piastre CYE-agar-streptomicina per 2 giorni a 37 gradi centigradi. Esaminare i livelli di espressione e la stabilità delle fusioni sfGFP mediante immunoblotting con un anticorpo anti-GFP.

3. Live Cell Imaging di L. pneumophila con fluorescently tagged Dot/Icm Componenti

  1. Preparazione di pastiglie di agarose
    1. Fare circa 30 mL di una soluzione di agarose a bassa fusione 1% in acqua. Microonde in una fiaschetta di vetro per circa 90 s, vorticoso di tanto in tanto, fino a quando l'agarose è completamente sciolto.
    2. Posizionare due vetrini divetro 22 x 22 x 0,15 mm sul bordo di uno scivolo divetro 3 25 x 75 x 1,1 mm, uno sopra l'altro. Impilare altri due vetrini invetro 22 x 22 x 0,15 mm sull'altro bordo.
    3. Pipette circa 1 mL di agarose fuso nella diapositiva centrale tra i due vetrini superiori, quindi posizionare un altro 25 x 75 x 1,1 mm3 scivolo sulla parte superiore dell'agarose fuso. Cercate di evitare la formazione di bolle d'aria. Raffreddare i vetrini a 4 gradi centigradi per 15 min.
    4. Utilizzando un bisturi o lama di rasoio, tagliare delicatamente il pad in piccoli quadrati, 5 x 5 mm2. Fissare un adesivo a doppio lato 17 x 28 x 0,25 mm3 fotogramma su un 25 x 75 x 1,1 mm3 vetrini di vetro e posizionare diversi pad sul vetrino.
  2. Acquisizione di immagini
    NOTA: i seguenti passaggi sono descritti per un microscopio che è sotto il controllo di SlideBook 6.0 e dotato di illuminatori a stato solido, fotocamera monocromatica CCD e un obiettivo 100x lente (1.4 apertura numerica). Se necessario, utilizzare dispositivi di microscopia alternativi con configurazioni hardware e software appropriate che possono essere personalizzate in base alle impostazioni del protocollo.
    1. Sciogliere un pezzo pesante di L. pneumophila in 1 mL di ddH2O, vortice e pipet 2–3 della diluizione sulle pastiglie. Posizionare un coperchio 50 x 24 x 0,15 mm3 delicatamente sul telaio adesivo.
    2. Nella finestra di cattura regolare l'ND a 180. Regolare il binning su 2/2 e utilizzare il canale 488 nm per esporre il campione tra 500-1.000 ms. Convalidare la specificità del segnale di fluorescenza mediante l'imaging senza tag L. pneumophila con gli stessi parametri (Figura 4).

4. Quantificazione della localizzazione polare e della dinamica dei componenti Dot/Icm

NOTA: i passaggi seguenti sono progettati per le immagini con 0,129 m per pixel che sono state acquisite con la binning 2 x 2.

  1. Quantificazione della polarità per le proteine di fusione sfGFP (Figura 5)
    1. Regolare il contrasto dell'immagine in modo che i batteri siano chiaramente visibili. Utilizzare lo strumento regione per posizionare un rettangolo di 0,25 x 1,3m2 partendo dal palo e estendendosi nel citoplasma. Il rettangolo deve rimanere preciso all'interno dei confini batterici.
    2. Contrassegnate almeno 200 batteri e utilizzate il pulsante Regione a maschera (Region to Mask) per creare maschere per le regioni di interesse. In Statistiche maschera e Ambito mascherascegliere Oggetto. Quindi, in Funzioni e intensità, contrassegnare Intensità media e Varianza.
    3. Esportare i dati e calcolare i punteggi di polarità di ogni batterio come rapporto tra la varianza e l'intensità media.
    4. Per le applicazioni ad alta velocità effettiva, le applicazioni con velocità elevata utilizzano un obiettivo di fase e un'impostazione del condensatore appropriata per acquisire immagini con la fase e canali di 488 nm. Assicurati di scegliere campi visivi in cui i batteri sono completamente separati.
    5. Regolare il contrasto del canale di fase dell'immagine a un livello in cui i batteri sono chiaramente visibili. Aprire l'immagine del doppio canale, aprire la finestra Crea maschera segmento e modificare il canale in fase.
    6. Regolare una soglia appropriata e rimuovere piccoli oggetti con il pulsante Definisci oggetti. In Affina maschera scegliere Rimuovi oggetti bordi e successivamente maschere separate di batteri adiacenti l'uno all'altro.
    7. Calcolare i punteggi di polarità del segnale nel canale 488 per ogni cella come descritto in precedenza nei passaggi 4.1.2–4.1.3.
  2. Quantificazione delle dinamiche per le proteine di fusione sfGFP (Figura 6)
    NOTA: seguire le istruzioni nella sezione 3 per preparare un esempio per l'acquisizione di immagini. Le dinamiche sono definite come cambiamenti di intensità nel tempo e i seguenti passaggi sono progettati per brevi periodi di imaging (ad esempio, diversi minuti). Aggiungere al pad gli integratori appropriati se si desiderano periodi di imaging più lunghi.
    1. Nella finestra Acquisizione immagine, selezionare Timelapse, immettere il tempo degli intervalli nella casella intervallo e immettere 2 nella casella Numero di punti temporali. Acquisire due immagini successive di L. pneumophila che esprime la proteina fluorescente di interesse.
    2. Regolare il contrasto dell'immagine fino a quando le celle non sono chiaramente visibili. Seguire la figura 6A e le descrizioni riportate di seguito per posizionare tre maschere diverse. Utilizzare lo strumento regione per posizionare un quadrato di 0,25 x 0,25 m al centro di almeno 400 celle.
    3. Usate il pulsante Regione a maschera per creare una maschera (maschera 1) dei quadrati di interesse. Creare una nuova maschera vuota (maschera 2) e utilizzare lo strumento pixel o lo strumento poligono per contrassegnare l'intera area della cella di almeno 25 celle casuali, che verrà utilizzato per calcolare lo sbiancamento a fluorescenza. Creare una nuova maschera vuota (maschera 3) e utilizzare lo strumento pennello di grandi dimensioni per contrassegnare le aree tra le celle, che verranno utilizzate per la sottrazione di sfondo.
    4. In Statistiche maschera e Ambito maschera, scegliere Oggetto per maschera1 e maschera 2. Quindi, in Funzioni e intensità, scegliere Intensità media ed esportare i dati delle due maschere. Per la maschera 3, esportare l'intensità media dell'intera maschera.
    5. Calcolare la variazione dell'intensità di fluorescenza per ogni oggetto nella maschera 1 utilizzando le seguenti formule:

Equation 1

Equation 2

dove la maschera 1 è un quadrato di 0,25 m e 0,25 m posto al centro della cella, la maschera 2 copre l'intera cella, la maschera 3 è lo sfondo tra le celle, t1 è l'intensità media nel primo punto temporale e t2 è l'intensità media nel secondo punto temporale.

5. Rilevamento della densità di massa sfGFP con Cryo-ET

  1. Preparazione, raccolta e ricostruzione dei campioni
    1. Coltiva un pezzo pesante di L. pneumophila esprimendo una proteina Dot/Icm fluorescente su piastre CYE-agar-streptomicina per 48 ore a 37 gradi centigradi. Risospendere le celle in ddH2O a600 0,7. Aggiungere 5 -L di particelle d'oro colloidali (BSA Tracer, 10 nm) a 20 -L della sospensione cellulare.
    2. Pipette 5 - L l della miscela cellulare sulla griglia di carbonio holey appena scaricato dal bagliore (R 2/1 su maglia Cu 200) e lasciare riposare per 1 min. Blot con carta da filtro e congelare in etano liquido utilizzando un apparato di stantuffo a gravità come descritto in precedenza14,15.
    3. Immagina i campioni congelati con un microscopio elettronico a trasmissione da 300 kV dotato di una pistola ad emissione da campo, un filtro energetico, una piastra di fase Volta e un dispositivo di rilevamento diretto. Raccogliere serie di inclinazione ad asse singolo a 26.000x e 42.000x ingrandimento, che si traducono in dimensioni dei pixel al livello del campione di 5,4 pixel o 3,4 x/pixel, rispettivamente.
    4. Utilizzare il pacchetto tomografico SerialEM per raccogliere pile di immagini a 0 m di defocus, con una gamma di angoli di inclinazione compresi tra -60 e 60 gradi con incremento di 3 gradini e una dose cumulativa di 60 e-/ 2,16. Allineare le immagini filmate frazionate di dose in ogni pila utilizzando MotionCor217. Assemblare pile corrette dalla deriva utilizzando TOMOAUTO14.
    5. Allineare le pile corrette dalla deriva mediante l'allineamento dipendente dal marcatore IMOD18. Ricostruire i tomogrammi con il metodo SIRT19 per le segmentazioni e l'analisi diretta delle immagini e il metodo WBP20.
  2. Analisi del subtomogramma dei campioni di fusioni sfGFP
    1. Utilizzare il pacchetto tomografico I3 (0.9.9.3) per l'analisi del sottotomogramma14,21,22.
      NOTA: l'allineamento procede in modo iterativo, con ogni iterazione costituita da tre parti in cui vengono generati riferimenti e maschere di classificazione, i subtogrammi allineati e classificati e le medie di classe sono allineate tra loro.
    2. Utilizzare 4 x 4 x 4 sottotomogrammi collocati per un tracciato iniziale. Unire le particelle che appartengono alle medie di classe e mostrano la densità degli elettroni corrispondente a sfGFP. Dopo aver smistato particelle con fusioni sfGFP, utilizzare 2 x 2 x 2 sottotomogrammi collocati per un allineamento mirato di una regione di interesse (come il complesso ATPase citoplasmico Dot/Icm) per ottenere una struttura ad alta risoluzione.

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Representative Results

La ricombinazione omologa con doppia selezione in due fasi è stata utilizzata per costruire l'inserimento definito di sfGFP. Nella prima fase, L'accoppiamento triparentale è stato eseguito, dove il plasmide coniugale pRK600 (un plasmide IncP) del ceppo di aiuto E. coli MT616 è stato mobilitato al ceppo E. coli del donatore con il vettore suicida pSR47S contenente il gene sfGFP affiancato dalle due regioni omologhe, l'origine dell'oriT di trasferimento e il gene bacillus subtilselection . Successivamente, il sistema di coniugazione da pRK600 mobilitazione assistita del derivato pSR47S in L. pneumophila (Lp01, Figura 2A). I cloni che hanno integrato con successo pSR47S con un singolo evento di crossover sono stati selezionati a causa del gene di resistenza agli antibiotici KanR e sono stati propagati per consentire un secondo crossover. Sono stati selezionati cloni che hanno perso il gene sacB durante il secondo crossover placcando le cellule sull'agente controselettivo (Figura 2, Figura 3). L'analisi dell'immunoblot con un anticorpo anti-GFP (z-GFP) è stata eseguita per determinare se l'sfGFP è stato fessurato e per valutare la stabilità e il livello di espressione della proteina di fusione in un tipo selvaggio o in un mutante completo di delezione di punti/icm. Inoltre, prima di procedere alla microscopia, la PCR(Figura 3)ha confermato la corretta integrazione del gene sfGFP nel cromosoma. Una volta confermata la stabilità e l'integrazione delle fusioni, è stata eseguita la microscopia fluorescente delle cellule vive e la specificità del clone del segnale fluorescente è stata confrontata con un ceppo parentale sfGFP-negativo. Inoltre, è stata utilizzata la doppia imaging utilizzando la microscopia a campo luminoso o di fase per esaminare la proporzione di cellule che possedevano un segnale fluorescente specifico (Figura 4).

Solo una frazione delle cellule che producevano DotB-sfGFP mostrava la localizzazione polare della proteina di fusione (Figura 5A). Per caratterizzare la distribuzione del segnale di fluorescenza DotB, è stata quantificata l'intensità di DotB-sfGFP lungo l'asse longitudinale in tali cellule. L'intensità dei puntib ai poli era circa 2 volte superiore a quella del citosol (Figura 5B). Poiché è importante determinare se la localizzazione delle proteine di fusione fluorescenti marcate ha rilevanza biologica, ci siamo chiesti se la localizzazione polare DotB-sfGFP dipendesse da un T4BSS completamente assemblato. Pertanto, i punteggi di polarità di DotB-sfGFP che indicano il rapporto di fluorescenza media misurata ai poli rispetto alla fluorescenza misurata vicino al centro della cellula sono stati determinati per singole cellule in un tipo selvaggio e in un mutante T4BSS (Figura 5C–E). Infatti, le cancellazioni dell'intero sistema Dot/Icm hanno abrogato il posizionamento polare di DotB-sfGFP, confermando che la puncta polare rappresenta l'associazione di DotB con il T4SS e l'importanza della macchina Dot/Icm per il reclutamento di questo ATPase. Nella maggior parte delle cellule di L. pneumophila, DotB-sfGFP ha anche mostrato movimento citosolico, indicando che è presente in una popolazione citosolica dinamica, ma è anche in grado di associarsi al complesso polare Dot/Icm. Per quantificare le differenze nel movimento dinamico tra gli ATPases DotO e DotB, sono state acquisite due immagini successive e sono state determinate le variazioni dell'intensità della fluorescenza e confrontate con sfGFP (Figura 6A). Mentre sfGFP e DotO-sfGFP hanno mostrato modelli dinamici poco o nessuno, i cambiamenti di intensità DotB-sfGFP nel citosol sono stati spostati ed erano significativamente più elevati. Queste osservazioni indicano che il DotB ATPase era presente in una popolazione citosolica dinamica e in una reazione di assemblaggio in fase avanzata, il DotB ATPase dinamica nel campo spaziale è stato reclutato nel T4SS Dot/Icm localizzato polarmente (Figura 6B).

Per definire la posizione spaziale di DotB rispetto alla macchina Dot/Icm, il crio-ET ad alta velocità è stato utilizzato per visualizzare l'apparato T4BSS intatto in un ceppo L. pneumophila che esprime DotB-sfGFP. In primo luogo, è stata eseguita la ricostruzione di una cellula L. pneumophila che esprime DotB-sfGFP e ha rivelato i tipici complessi multipli a forma di cono incorporati nella busta cellulare (Figura 7A, B). Abbiamo dimostrato in precedenza utilizzando esperimenti epistatici con una varietà di mutanti Dot/Icm, microscopia fluorescente e crio-ET che DotB si trova spazialmente sotto un'assemblea unica dell'ATPase DotO10. Il subtomogramma in media del ceppo che esprime DotB-sfGFP ha determinato il posizionamento complessivo di DotB in relazione alla macchina T4BSS intatta. Questa analisi ha rivelato una correlazione di densità aggiuntiva con la massa aggiuntiva di sfGFP(Figura 7C). Infine, i rendering tridimensionali della superficie dell'intero Dot/Icm T4SS indicano che sfGFP è posizionato sotto l'esamero DotB, che si assembla come disco alla base del complesso atPase citoplasmico (Figura 8)10.

Figure 1
Figura 1: Rendering tridimensionali della superficie di L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM - membrana esterna, IM - membrana interna, PG - peptidoglycan. L'immagine è stata modificata da Chetrit D. etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Panoramica schematica della ricombinazione omologa e dello scambio allelico utilizzato per inserire sfGFP nel cromosoma L. pneumophila. (A) Accoppiamento triparentale eseguito tra un ceppo di supporto E. coli MT616 che ospita il plasmide coniugale pRK600 (un plasmide IncP), un ceppo E. coli del donatore che si trasforma con il vettore suicida pSR47S e L. pneumophila come destinatario. (B) Modello schematico che illustra i passaggi necessari per inserire sfGFP nel cromosoma L. pneumophila al fine di generare proteine di fusione sfGFP terminali C. La selezione dei mutanti di scambio allelico è stata effettuata in due fasi, utilizzando la kanamicicina e il contatore selezionabile marcatore sacB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Flusso di lavoro di scambio allelico. L. pneumophila è stata striata sulle selezioni e sui tempi di crescita appropriati (vedere la sezione del protocollo per i dettagli). Successivamente, l'inserimento di sfGFP nel cromosoma è stato confermato con colonia PCR utilizzando primer complementari al gene sfGFP e alla regione cromosomica che fiancheggia il sito di inserimento. La stabilità della proteina di fusione è stata esaminata mediante l'analisi dell'immunoblot utilizzando un anticorpo anti-GFP. Pannelli in basso a sinistra: Lane 1 - senza tag Lp01, Lane2 , sfGFP espresso da dotB operon, Lane 3 - DotB-sfGFP espresso in un completo mutare di eliminazione punto/ icm, Lane 4 - DotB-sfGFP espresso in uno sfondo di tipo selvaggio. W.Blot occidentale. Il numero di cloni analizzati in ogni passaggio è indicato tra parentesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging a cellule vive di L. pneumophila che esprimono sottounità Dot/Icm fluorescenti. (A) L. pneumophila da un cerotto pesante di due giorni è stato risospeso in ddH2O e posto sopra 1% pastiglie di agarose a bassa fusione. (B) La specificità del segnale di fluorescenza di un ceppo che codifica cromosomicamente DotB-sfGFP è stata confrontata con il ceppo GFP-negativo Lp01 parentale. Barra della scala: 3 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Quantificazione della localizzazione polare delle sottounità di sistema Punto/Icm. (A) La visualizzazione in tempo reale di DotB-sfGFP espressa in Lp01 ha mostrato la localizzazione polare. DotB-sfGFP ha mostrato un modello diffuso quando espresso in un ceppo in cui è stato eliminato l'intero cluster genico punto/icm (T4SS). SfGFP non fuso espresso dall'operone dotB ha mostrato un modello citosolico diffuso e servito come controllo. Barra della scala: 3 m. (B) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza DotB-sfGFP lungo l'asse longitudinale delle cellule con modelli polari o diffusi. Le dimensioni dei campioni erano n - 20 cellule per le cellule polari e non polari. 0,02,p , 0,0001 USD. Il significato è stato calcolato dal test t di Student a due code e confrontato con l'intensità al palo. (C) Modello schematico delle maschere utilizzate per quantificare la polarità. (D) DotB-sfGFP come mostrato nella Figura 5A con le maschere utilizzate per quantificare la polarità. (E) L'abbondanza di DotB-sfGFP ai poli, quando è espressa in uno sfondo selvaggio o quando l'intero cluster genico punto/icm è stato eliminato, viene visualizzata come curve di frequenza. Le dimensioni dei campioni erano n di cellule per ogni ceppo. p < 0.0001. Il significato è stato calcolato dal test Mann Whitney a due code e confrontato con sfGFP espresso dall'operone dotB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Quantificazione delle dinamiche delle fusioni fluorescenti punto/Icm. (A) Un modello schematico che raffigura le maschere utilizzate per quantificare i cambiamenti dell'intensità della fluorescenza per una proteina di fusione sfGFP dinamica o statica. T1,2 sono il tempo del primo e del secondo tempo punti e m1,2,3 sono maschera 1, maschera 2, e maschera 3. (B) Le dinamiche di DotB-sfGFP, DotO-sfGFP e sfGFP espresse dall'operone dotB vengono visualizzate come curve di frequenza. Le dimensioni dei campioni erano n di cellule per ogni ceppo. -3,4 x 10-12,p , 1,0 e 10-147. L'importanza è stata calcolata dal test t di Student a due code rispetto a sfGFP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: La media del sottotomogramma viene utilizzata per determinare la densità di sfGFP di DotB-sfGFP. (A) Una fetta tomografica acquisita con un ingrandimento di 26.000x da una cella rappresentativa di L. pneumophila che esprime DotB-sfGFP, mostrando più macchine Punto/Icm incorporate nella busta cellulare. (B) Una fetta tomografica acquisita con un ingrandimento di 42.000x dello stesso palo cellulare di L. pneumophila mostrato in A. OM - membrana esterna, IM - membrana interna. (C) Una ricostruzione di un ceppo che esprime DotB-sfGFP mostra densità corrispondenti a DotB e sfGFP (frecce gialle). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Rendering tridimensionali della superficie del complesso citosolico punto/Icm. Rendering di superficie tridimensionali dell'intero Dot-Icm T4SS da ,dotB (A), tipo selvaggio (B) e dotB-gfp (C) L. pneumophila ceppi. (D) La struttura del complesso citosolico mostra il posizionamento di DotB (viola) e sfGFP (verde). La struttura a raggi X di DotB (PDB: 6GEB23) è stata ancorata alla mappa DotB. IM - membrana interna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Chiarire le funzioni dei sistemi di secrezione batterica è fondamentale per una comprensione completa delle interazioni ospite-patogeno. I sistemi di secrezione sono macchine complesse che possono iniettare proteine efricchenti nelle cellule ospiti e in alcuni casi promuovono la creazione di una nicchia subcellulare che supporta la replicazione batterica. Il metodo di cui sopra fornisce importanti nuovi strumenti per studiare il sistema di secrezione punto/Icm del patogeno batterico respiratorio Legionella pneumophila, producendo indizi sui meccanismi di traslocazione degli efsiati che sono essenziali per la sua patogenicità. Questo approccio può essere applicato ad altri sistemi di secrezione impiegando l'imaging di cellule batteriche vive e studi strutturali per sezionare la loro attività a livello molecolare. Questo può essere ottenuto studiando le dinamiche spatiotemporali dei componenti del sistema di secrezione fluorescentmente etichettati utilizzando la microscopia video time-lapse.

Abbiamo costruito mutazioni pulite e non marcate, in cui un gene è stato etichettato o sostituito da un allele modificato, che è un approccio fondamentale per la comprensione della patogenicità a livello molecolare e per la definizione di relazioni struttura-funzione che possono portare alla produzione di terapie farmacologiche24,25. I ceppi di L. pneumophila che sono stati geneticamente modificati per eliminare le singole proteine Dot e Icm possono essere utilizzati per determinare la struttura del sistema Dot/Icm da cryo-ET. Un passo importante nel protocollo è confrontare la funzionalità delle proteine marcate N-terminus e C-terminus. Pertanto, i ceppi che codificano le fusioni dovrebbero essere testati per la replicazione nelle cellule ospiti eucariotiche, visualizzati mediante microscopia per determinare se la localizzazione delle proteine marcate nella cellula batterica dipende da una macchina di secrezione completamente assemblata e valutata per la stabilità delle proteine espresse dai geni a monte e a valle.

Questo protocollo utilizza esperimenti di microscopia cellulare viva, che sono ampiamente utilizzati per studiare processi biologici complessi come la trasduzione del segnale, l'auto-assemblaggio, il traffico attivo e la regolazione genica. Comprendere le dinamiche, le traiettorie e le interazioni delle singole particelle nelle cellule rappresenta un approccio fondamentale nella biologia cellulare26. Tuttavia, dato che il tracciamento di singole particelle potrebbe non essere sempre possibile a causa del rapido movimento molecolare o del basso rapporto segnale-rumore, la valutazione dei cambiamenti nell'intensità della fluorescenza può servire come approccio diretto per quantificare le differenze nei modelli dinamici. Inoltre, poiché per l'analisi sono necessari solo due punti temporali, questa metodologia garantisce solo un'esposizione minima del campione alla luce fluorescente e previene quindi un maggiore sbiancamento dell'intensità di fluorescenza sfGFP. Poiché le pastiglie di agarose non contengono alcuna fonte di nutrienti, è importante notare che l'imaging dal vivo deve essere eseguito immediatamente dopo aver preso le cellule dalle piastre di agar CYE. Se sono necessari periodi più lunghi di tempo di imaging, allora gli integratori che supportano la sopravvivenza e la crescita di L. pneumophila dovrebbero essere aggiunti alle pastiglie. Determinare la polarità delle proteine fluorescenti con tag può anche essere modificato per applicazioni ad alto throughput. Se questi sono necessari, è necessario utilizzare un obiettivo di fase e un'appropriata configurazione del condensatore per acquisire immagini a doppio canale (ad esempio, canali di fase e fluorescenti). È fondamentale scegliere i campi in cui i batteri sono completamente separati. Utilizzare il canale di fase per mascherare intere celle e quantificare il rapporto di intensità come descritto in precedenza.

La microscopia crioelettronica (crio-EM) e crio-ET offrono una robusta visualizzazione delle nanoparticelle. Queste tecniche prevedono l'imaging del campione in uno stato di idratazione congelata, consentendo la visualizzazione delle nanoparticelle essenzialmente come esistono nel loro ambiente cellulare27. Poiché la risoluzione è limitata dallo spessore del campione, le strutture ottenute dal crio-ET hanno una risoluzione inferiore rispetto a quelle ottenute dal crio-eM. Tuttavia, poiché in ogni immagine i macchinari di tipo IV sono presenti in più copie, è possibile ottenere una maggiore risoluzione aumentando la dimensione del campione per il sottotomogramma in media. Uno dei principali vantaggi del crio-ET è che la visualizzazione di assemblaggi complessi in cellule batteriche intatte può conservare meglio la loro struttura, che può subire drastici cambiamenti al momento dell'estrazione dal loro ambiente naturale.

In conclusione, lo studio dei processi dinamici e la localizzazione delle molecole sono tra i primi passi verso la comprensione della funzione dei sistemi biologici. La forza e la messa a fuoco del metodo qui descritto è la visualizzazione diretta dei componenti Punto/Icm nei batteri viventi, che offre la possibilità di scoprire processi dinamici che regolano le funzioni delle macchine di tipo IVB o di altri gruppi multiproteine. Inoltre, l'accoppiamento dell'imaging dal vivo al crio-ET è una strategia che consente la caratterizzazione dei componenti chiave della macchina Dot/Icm in relazione alla maggiore struttura del sistema di secrezione Legionella pneumophila e la comprensione di come assemblano e conformazionali diretti cambiamenti nell'apparato. Una limitazione dei tag proteici fluorescenti utilizzati per studiare il comportamento delle proteine nelle cellule viventi è la loro dimensione relativamente grande, che potrebbe influenzare la funzione e le proprietà della proteina marcata. Successivamente, è necessaria una valutazione della stabilità e della funzionalità. Un'altra limitazione di questo approccio è che attualmente le strutture atomiche non possono essere ottenute a causa della risoluzione limitata derivante dallo spessore del campione. La modellazione e l'adattamento possono essere un modo efficace per analizzare le densità, consentendo così la localizzazione delle sottounità o la valutazione dei cambiamenti conformazionali. Le indagini future e l'ulteriore perfezione di questo approccio porteranno a una migliore comprensione di come i diversi sottoassiemi comprendano un apparato funzionale di tipo IV.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

D.C. e C.R.R. sono stati supportati dai NIH (R37AI041699 e R21AI130671). D.P., B.H.e J.L sono stati supportati dai National Institutes of Health (R01AI087946 e R01GM107629).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22x22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

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References

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Immunologia e Infezione Numero 157 Legionella pneumophila Malattia dei Legionari infezione respiratoria patogeni batterici intracellulari sistema di secrezione di tipo IV sistema di secrezione di Punti/Icm imaging delle cellule vive dinamica spatiotemporale microscopia quantitativa a fluorescenza tomografia crioelettronica strutture cellulari scambio allecola
Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione <em>Legionella pneumophila</em> Dot/Icm
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Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

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