Denne protokol beskriver en effektiv elektroporationsmetode til omladning af fire forskellige gastrointestinale organoidenheder med større plasmider (i det omfang 10 kB). Det kan udføres inden for en dag og behøver ikke omfattende forberedelse eller særlige, omkostningskrævende elektroporation buffere.
Elektroporation er en almindelig metode til omladning med forskellige typer af molekyler ved elektrisk permeabilisering af plasmamembranen. Med den stigende brug af organoider som en dyrkningsmetode for primærpatientmateriale i de seneste år er der behov for effektive overførselsmetoder for komponenter til genteknologi i dette 3D-kultursystem. Især for organoider, effektiviteten af genetiske manipulationer afhænger af en vellykket transfection. Denne protokol blev således udviklet for at lette elektroporationen af organoider og for at bevise dens universelle funktionalitet i forskellige enheder. Human kolorektal, pancreas, hepatisk og gastrisk kræft organoids blev med succes elektroporated med små og store plasmider i sammenligning. Baseret på GFP-kodningsvektorer blev transfektionseffektiviteten bestemt af FACS. Ingen omfattende forberedelse af cellerne eller særlige, omkostningskrævende elektroporation buffere er nødvendige, og protokollen kan udføres inden for en dag.
I de seneste år, en ny 3D celle kultur system, benævnt organoider, blev udviklet til forskellige normale og kræftvæv. Organoider er funktionelt og morfologisk meget tæt på deres væv af oprindelse. De kan genereres fra forskellige arter, er let kan udvides, genomisk stabil og genetisk modificerbare, hvilket gør dem til et ideelt modelsystem for genetiske undersøgelser1,2,3. Genteknologiske teknikker som CRISPR (Clustered Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 system giver forskellige manipulationer. Udvælgelsen af kloner kan realiseres ved definerede medieforhold, for eksempel ved WNT ligand tilbagetrækning for APC (Adenomaosis Polyposis Coli) knockout kloner4,5. Alternativt skal markeringsmarkørerne indføres ved homologrettet reparation af en målretningsvektor6,7. På grund af det faktum, at ofte mere end én plasmid skal indføres, en effektiv omladning bliver et afgørende parameter. For at reducere uspecifikke virkninger uden for målet er det desuden ønskeligt, at Cas9-endonuclease er forbigående8.
Elektroporation er en forholdsvis enkel metode til at transfect celler med DNA, RNA, proteiner eller andre makromolekyler. Ved hjælp af elektriske impulser bliver cellemembranen mere gennemtrængelig og forårsager en øget optagelse9. I en tidligere offentliggjort elektroporation protokol af kolon organoider en 30 % effektivitet med en piggy-bac GFP (grøn fluorescerende protein) udtrykke vektor (7,4 kB) blev nået i en fire dages procedure10. Følgende protokol blev udviklet for at lette en effektiv transfection af kræft eller sunde organoider med store plasmider kodning for enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease sekvens (f.eks px458 som vektor med 9,3 kb). Hele elektroporationsprocessen kan udføres inden for en dag, uden særlige elektroporation buffere, og med mindst sammenlignelige effektivitetsgevinster mellem forskellige gastrointestinale organoider, nemlig pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), kolorektal cancer (CRC), cholangiocarcinoma (CCC) og mavekræft (GC) organoids.
Denne protokol giver detaljerede instruktioner til en effektiv, hurtig og nem at udføre elektroporation af forskellige organoid enheder. Ud over de præsenterede tumor organoider fra PDAC, CRC, CCC og GC, det virker med succes for organoider stammer fra sundt væv samt. Protokollen kan udføres inden for en dag. I offentliggjorte organoidomladningsprotokoller varede hele proceduren fire dage , herunder to dages præparater med forskellige typer dyrkningsmedier10,21. I vores protokol kræves der ingen særbehandling. Ved at vaske med elektroporation buffer før elektroporation antibiotiske komponenter i medierne blev vasket ud og en justering af saltvand koncentrationer for optimal impedans værdier blev opnået. Ikke desto mindre bør nogle kritiske aspekter overvejes for en vellykket elektroporation:
Celler
I fujii et al.10’s elektroporationsprotokol anbefales det at adskille organoider til enkelte celler og filtrere dem gennem en cellesier på 20 μm. I vores hænder fordøjelse til enkelte celler kraftigt nedsætter overlevelsesevne af celler. Som foreslået i Merenda et al.21,vi også dissociated organoider til klynger af 10-15 celler og kunne ikke bestemme en nedsat effektivitet i forhold til en enkelt celle dissociation. Efter elektroporation, er det et meget vigtigt skridt at adskille det hvide skum, således at ingen vedhæftede celler er faret vild.
For 2D celle kultur, har det vist sig, at en regenerering tid efter elektroporation på mere end 10 min op til 40 min øger overlevelsesevne og omplantning effektivitet især af store plasmider22. I testforsøg kunne det samme dokumenteres for organoider, hvilket fører til et inkubationstrin på 40 min efter elektroporation i denne protokol. For at øge inddrivelsen fra elektroporationen, vi dyrkede dem med Rho-associerede protein kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 i fem til syv dage23. Tilsvarende, den ekstra tilskud af glykogen syntase kinase 3 (GSK3) hæmmer CHIR99021 er beregnet til at hjælpe enkelte celler til at inddrive10.
Indstillinger
En af fordelene ved den brugte elektroporator er, at impedansen kan måles før elektroporation for optimale forhold. Ifølge producenten skal impedansværdierne være 30-55 Ω. I vores hænder har impedansværdier på 30-40 Ω vist optimal effektivitet. I et indledende eksperiment blev forskellige spændinger og pulslængdeværdier for poringpulsen varieret for at finde den optimale andel af effektiviteten til overlevelsesevne. Sammenfattende kunne vi bekræfte de beskrevne værdier Fujii et al.10 i de forskellige enheder, der er beskrevet her.
Dna
Virkningen af forskellige DNA-mængder blev testet i indledende forsøg på op til 45 μg DNA pr. prøve. Der kunne ikke påvises cytotoksiske virkninger. Transfektionseffektiviteten blev øget på en dosisafhængig måde med mætning > 30 μg. Så vi brugte 30 μg pr. prøve i den endelige protokol, men den kan naturligvis øges (f.eks. til elektroporation af flere plasmider parallelt). Derudover synes dna’ets renhed og koncentration at være meget vigtig. En koncentration på over 5 μg/μL har vist optimal transfektionseffektivitet.
Som forventet kunne plasmiden på 9,3 kB transfected med en lavere effektivitet end de mindre 4,2 kB plasmid (se figur 4). Brugen af endnu større plasmider end 10 kB forventes at yderligere mindske effektiviteten. For fremtidige anvendelser, kan det være interessant at teste minicircle DNA som en vektor, da disse genbærere mangler den bakterielle rygrad en plasmid hvilket gør dem mindre24. Dette bør resultere i en forbedret transfektionseffektivitet. Desuden, for CRISPR-baserede manipulationer af organoider en direkte elektroporation af sgRNAs bundet til Cas9 som en ribonucleoprotein (RNP) kompleks kunne være et alternativ eller tilføjelse25.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke og Max Heiduk for fremragende teknisk bistand. Deutsche Krebshilfe (nr. 111350 og 70112925), Sander Stiftung (nr. 2014.104.1), Hector Stiftung (nr.
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |