Este protocolo descreve um método eficiente de eletroporação para a transfecção de quatro diferentes entidades organoides gastrointestinais com plasmídeos maiores (na extensão de 10 kB). Pode ser realizado dentro de um dia e não precisa de extensa preparação ou tampões especiais de eletroporação econômicos.
A eletroporação é um método comum para transfecção com diferentes tipos de moléculas por permeabilização elétrica da membrana plasmática. Com o uso crescente de organoides como método de culturingpara material primário do paciente nos últimos anos, estão necessitados métodos eficientes de transferência de componentes para engenharia genética neste sistema de cultura 3D. Especialmente para organoides, a eficiência das manipulações genéticas depende de uma transfecção bem sucedida. Assim, esse protocolo foi desenvolvido para facilitar a eletroporação de organoides e para comprovar sua funcionalidade universal em diferentes entidades. Organoides colorretais, pancreáticos, hepáticos e gástricos foram eletroporados com sucesso com pequenos e grandes plasmídeos em comparação. Com base em vetores de codificação gfp, a eficiência de transfecção foi determinada pela FACS. Não é necessário uma preparação extensiva das células ou tampões especiais de eletroporação intensiva e econômica, e o protocolo pode ser realizado dentro de um dia.
Nos últimos anos, um novo sistema de cultura celular 3D, chamado organoides, foi desenvolvido para vários tecidos normais e cancerosos. Organoides são funcionais e morfologicamente muito próximos de seu tecido de origem. Elas podem ser geradas a partir de diferentes espécies, são facilmente expansíveis, genomicamente estáveis e geneticamente modificáveis, o que as torna um sistema modelo ideal para investigações genéticas1,2,3. Técnicas de engenharia genética como o CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permitem diversas manipulações. A seleção de clones pode ser realizada por condições de mídia definidas, por exemplo, por meio da WNT ligand withdrawal para aaPC (Adenomatosis Polyposis Coli) clones knockout4,5. Alternativamente, os marcadores de seleção devem ser introduzidos pelo reparo direcionado homologous de um vetor de alvo6,7. Devido ao fato de que muitas vezes mais de um plasmídeo precisa ser introduzido, uma transfecção eficiente torna-se um parâmetro crucial. Além disso, para reduzir efeitos fora do alvo inespecíficos, uma expressão transitória da endonuclocação cas9 é desejável8.
A eletroporação é um método relativamente simples para transfect células com DNA, RNA, proteínas ou outras macromoléculas. Por meio de pulsos elétricos, a membrana celular torna-se mais permeável e causa um aumento da captação9. Em um protocolo de eletroporação publicado anteriormente de organoides de cólon, uma eficiência de 30 % com um vetores expresso de cofic-bac (proteína fluorescente verde) expressando vetor (7,4 kB) foi alcançado em um procedimento de quatro dias10. O seguinte protocolo foi desenvolvido para facilitar uma transfecção eficiente de organoides cancerosos ou saudáveis com grande codificação plasmídeos para RNA guia único (sgRNA) e a sequência cas9 endonuclease (por exemplo, px458 como vetor com 9,3 kb). Todo o processo de eletroporação pode ser realizado dentro de um dia, sem tampões especiais de eletroporação, e com pelo menos eficiências comparáveis entre diferentes organoides gastrointestinais, ou seja, adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), câncer colorretal (CRC), cholangiocarcinoma (CCC) e organoides de câncer gástrico (GC).
Este protocolo fornece instruções detalhadas para uma eletroporação eficiente, rápida e fácil de realizar de diferentes entidades organoides. Além dos organoides tumorais apresentados de PDAC, CRC, CCC e GC, funciona com sucesso para organoides derivados de tecido saudável também. O protocolo pode ser realizado dentro de um dia. Em protocolos de transfecção organoide publicados, todo o procedimento durou quatro dias, incluindo dois dias de preparações com diferentes tipos de mídia de cultivo10,21. Em nosso protocolo não é necessário pré-tratamento especial. Ao lavar com tampão de eletroporação antes da eletroporação, os componentes antibióticos da mídia foram lavados e um ajuste das concentrações salinos para valores ideais de impedância foi alcançado. No entanto, alguns aspectos críticos devem ser considerados para uma eletroporação bem sucedida:
Células
No protocolo de eletroporação de Fujii et al.10 é recomendável dissociar organoides para células únicas e filanhê-los através de um filtro de células de 20 μm. Em nossas mãos, a digestão de células únicas diminui fortemente a sobrevivência das células. Como sugerido em Merenda et al.21,também dissociamos organoides para aglomerados de 10-15 células e não conseguimos determinar uma diminuição da eficiência em comparação com a dissociação de células únicas. Após a eletroporação, é um passo muito importante para dissociar a espuma branca, para que nenhuma célula anexa esteja se perdendo.
Para a cultura celular 2D, mostrou-se que um tempo de regeneração após a eletroporação de mais de 10 min até 40 min aumenta a capacidade de sobrevivência e a eficiência da transfecção especialmente de grandes plasmídeos22. Em experimentos de teste, o mesmo poderia ser documentado para organoides, levando a uma etapa de incubação de 40 min após a eletroporação neste protocolo. Para aumentar a recuperação da eletroporação, nós os culturamos com o inibidor de proteína associada à Rho (ROCK) Y-27632 por cinco a sete dias23. Da mesma forma, a suplementação adicional do inibidor de synthase sintetizada 3 (GSK3) de glicogênio é destinada a ajudar células únicas a recuperar10.
Configurações
Uma das vantagens do eletroporator usado é que a impedância pode ser medida antes da eletroporação para condições ideais. De acordo com o fabricante, os valores de impedância devem ser de 30-55 Ω. Em nossas mãos, os valores de impedância de 30-40 Ω mostraram eficiências ideais. Em um experimento preliminar, diferentes tensões e valores de comprimento de pulso do pulso de porção foram variados para encontrar a proporção ideal de eficiência para a sobrevivência. Em resumo, pudemos confirmar os valores descritos de Fujii et al.10 nas diferentes entidades aqui descritas.
Dna
O efeito de diferentes quantidades de DNA foi testado em experimentos preliminares de até 45 μg de DNA por amostra. Nenhum efeito citotóxico pode ser detectado. A eficiência da transfecção foi aumentada de forma dependente de dose com saturação > 30 μg. Então, usamos 30 μg por amostra no protocolo final, mas é claro que pode ser aumentado (por exemplo, para a eletroporação de mais plasmídeos em paralelo). Além disso, a pureza e concentração do DNA parecem ser muito importantes. Uma concentração superior a 5 μg/μL mostrou eficiências de transfecção ideais.
Como esperado, o plasmídeo de 9,3 kB poderia ser transfeclado com uma eficiência menor do que o menor plasmídeo de 4,2 kB (ver Figura 4). O uso de plasmídeos ainda maiores do que 10 kB deve diminuir ainda mais a eficiência. Para aplicações futuras, pode ser interessante testar o DNA do minicírculo como vetor, uma vez que esses portadores de genes não têm a espinha dorsal bacteriana de um plasmídeo que os torna menores24. Isso deve resultar em uma maior eficiência de transfecção. Além disso, para manipulações baseadas em CRISPR de organoides, uma eletroporação direta de sgRNAs ligadas a Cas9 como um complexo de ribonucleoproteína (RNP) pode ser uma alternativa ouadição 25.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke e Max Heiduk por excelente assistência técnica. O financiamento foi fornecido pela Deutsche Krebshilfe (nº 111350 e 70112925), Sander Stiftung (Nº 2014.104.1), Hector Stiftung (No M65.2) e pela União Europeia (ERC nº 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |