Bu protokol, daha büyük plazmidlere sahip dört farklı gastrointestinal organoid varlığın transfeksiyonu için etkili bir elektroporasyon yöntemini açıklar (10 kB ölçüde). Bir gün içinde yapılabilir ve kapsamlı hazırlık veya özel, maliyet yoğun elektroporasyon tamponlar gerektirmez.
Elektroporasyon plazma zarının elektriksel permeabilizasyonu ile farklı moleküllerle transfeksiyon için yaygın bir yöntemdir. Son yıllarda birincil hasta materyali için bir kültür yöntemi olarak organoidlerin giderek artan kullanımı ile, bu 3D kültür sisteminde genetik mühendisliği için bileşenlerin verimli transfer yöntemleri ne zaman ihtiyaç vardır. Özellikle organoidler için, genetik manipülasyonların etkinliği başarılı bir transfeksiyona bağlıdır. Böylece bu protokol, organoidlerin elektroporasyonunu kolaylaştırmak ve farklı varlıklardaki evrensel işlevselliğini kanıtlamak için geliştirilmiştir. İnsan kolorektal, pankreas, hepatik ve mide kanseri organoidleri küçük ve büyük plazmidlerle başarılı bir şekilde elektroporated edildi. GFP kodlama vektörlerine dayanarak transfeksiyon verimliliği FACS tarafından belirlendi. Hücrelerin kapsamlı bir şekilde hazırlanması veya özel, maliyet yoğun elektroporasyon tamponları gerekli değildir ve protokol bir gün içinde gerçekleştirilebilir.
Son yıllarda, yeni bir 3D hücre kültür sistemi, organoidler olarak adlandırdığı, çeşitli normal ve kanserli dokular için geliştirilmiştir. Organoidler fonksiyonel ve morfolojik olarak menşe dokularına çok yakındırlar. Onlar farklı türlerden oluşturulabilir, kolayca genişletilebilir, genomik kararlı ve genetik olarak değiştirilebilir, hangi onları genetik araştırmalar için ideal bir model sistemi yapar1,2,3. CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar)/Cas9 sistemi gibi genetik mühendislik teknikleri çeşitli manipülasyonlara olanak sağlar. Klonların seçimi tanımlanmış medya koşulları ile gerçekleştirilebilir, örneğin, APC için WNT ligand çekilmesi (Adenomatozis Polypozis Coli) nakavt klonları4,5. Alternatif olarak, seçim işaretleri bir hedeflemevektörü homologyönettiği onarım tarafından tanıtılması gerekir 6,7. Genellikle birden fazla plazmid intülisi getirilmesi gerektiğinden, verimli bir transfeksiyon çok önemli bir parametre haline gelir. Ayrıca, belirsiz off-hedef etkilerini azaltmak için, Cas9 enonukleaz geçici bir ifade8arzu edilir .
Elektroporasyon DNA, RNA, proteinler veya diğer makromoleküller ile transfect hücreleri için nispeten basit bir yöntemdir. Elektrik darbeleri sayesinde, hücre zarı daha geçirilebilir hale gelir ve artan bir alım nedenolur 9. Kolon organoidlerinin daha önce yayınlanmış bir elektroporasyon protokolünde, dört günlük bir işlemle piggy-bac GFP (yeşil floresan protein) ile%30verimlilik (yeşil floresan protein) ekspresyonu (7.4 kB) sağlandı. Aşağıdaki protokol, tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cas9 ensonükleaz dizisi (örneğin 9.3 kb ile vektör olarak px458) için kodlayan büyük plazmidler ile kanserli veya sağlıklı organoidlerin verimli bir şekilde transfeksiyonunu kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Tüm elektroporasyon süreci bir gün içinde yapılabilir, özel elektroporasyon tamponlar olmadan, ve farklı gastrointestinal organoidler arasında en azından karşılaştırılabilir verimlilikile, yani pankreas duktal adenokarsinom (PDAC), kolorektal kanser (CRC), kolanjiokarsinom (CCC) ve mide kanseri (GC) organoidler.
Bu protokol, farklı organoid varlıkların etkin, hızlı ve kolay elektroporasyon gerçekleştirmek için ayrıntılı talimatlar verir. PDAC, CRC, CCC ve GC’den sunulan tümör organoidlerine ek olarak, sağlıklı dokudan elde edilen organoidler için de başarılı bir şekilde çalışır. Protokol bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Yayınlanan organoid transfeksiyon protokollerinde tüm prosedür dört gün boyunca iki gün boyunca farklı türde yetiştirme ortamı ile hazırlıklar10,21. Protokolümüzde özel bir ön tedavi gerekmez. Elektroporasyon öncesi elektroporasyon tamponu ile yıkanarak ortamın antibiyotik bileşenleri yıkanmış ve optimal empedans değerleri için tuzlu konsantrasyonlarda ayarlama sağlanmıştır. Yine de, bazı kritik yönleri başarılı bir elektroporasyon için düşünülmelidir:
Hücre
Fujii ve ark.10 tarafından yapılan elektroporasyon protokolünde organoidleri tek hücrelere ayırmak ve 20 μm’lik hücre süzgecinden geçirmek önerilir. Elimizde tek hücrelere sindirim güçlü hücrelerin hayatta kalma azaltır. Merenda ve ark.21’deönerildiği gibi, organoidleri 10-15 hücrekümelerine ayırdık ve tek hücreli ayrışmaya göre verimin azaldığını belirleyemedik. Elektroporasyondan sonra, beyaz köpük ayrıştırmak için çok önemli bir adımdır, böylece hiçbir bağlı hücreler kayboluyor.
2B hücre kültürü için, 10 dakikadan 40 dakikaya kadar elektroporasyondan sonra bir rejenerasyon süresinin özellikle büyük plazmidlerin hayatta kalma ve transfeksiyon verimliliğini artırdığı gösterilmiştir22. Test deneylerinde, aynı organoidler için belgelenebilir, bu protokolde elektroporasyon dan sonra 40 dk kuluçka adım yol açan. Elektroporasyondan iyileşmeyi artırmak için, rho-ilişkili protein kigaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 ile beş ila yedi gün23kültürlü. Benzer şekilde, glikojen synthase kiaz 3 ek takviyesi (GSK3) inhibitörü CHIR9902110kurtarmak için tek hücrelere yardımcı olmak içindir.
Ayarlar
Kullanılan elektroporatörün avantajlarından biri, empedansın en uygun koşullarda elektroporasyondan önce ölçülebiliyor olmasıdır. Üreticiye göre empedans değerleri 30-55 Ω olmalıdır. Elimizde 30-40 Ω empedans değerleri optimum verimlilik göstermiştir. Bir ön deneyde, poring pulse’un farklı gerilimleri ve darbe uzunluk değerleri, hayatta kalmanın en uygun verim oranını bulmak için çeşitlidir. Özetle, burada açıklanan farklı varlıklarda Fujii ve ark.10’un açıklanan değerlerini doğrulayabiliriz.
Dna
Farklı DNA miktarlarının etkisi, numune başına 45 μg’a kadar olan ön deneylerde test edildi. Sitotoksik etki saptayamadı. Doygunluk > 30 μg ile doza bağımlı bir şekilde transfeksiyon verimi artırıldı. Bu yüzden, son protokolde numune başına 30 μg kullandık, ama tabii ki artırılabilir (örn. paralel olarak daha fazla plazmidin elektroporasyonu için). Ayrıca, DNA’nın saflığı ve konsantrasyonu çok önemli görünüyor. 5 μg/μL’yi aşan bir konsantrasyon optimal transfeksiyon verimi göstermiştir.
Beklendiği gibi, 9.3 kB plazmid daha küçük 4.2 kB plazmid daha düşük bir verimlilik ile transfected olabilir (Şekil 4bakınız). 10 kB’den daha büyük plazmidlerin kullanımının verimliliği daha da azaltması bekleniyor. Gelecekteki uygulamalar için, bu gen taşıyıcıları onları daha küçük24kılan bir plazmid bakteriyel omurga sıyrık eksikliği beri, bir vektör olarak minicircle DNA test etmek ilginç olabilir. Bu gelişmiş bir transfeksiyon verimliliği neden olmalıdır. Ayrıca, organoidlerin CRISPR tabanlı manipülasyonlar için bir ribonükleoprotein olarak Cas9 bağlı sgRNA doğrudan elektroporasyon (RNP) kompleksi alternatif veya ek25olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz mükemmel teknik yardım için Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke ve Max Heiduk teşekkür ederiz. Finansman Deutsche Krebshilfe (No 111350 ve 70112925), Sander Stiftung (No 2014.104.1), Hector Stiftung (No M65.2) ve Avrupa Birliği (ERC No 639050) tarafından sağlanmıştır.
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |