פרוטוקול זה מתאר שיטת אלקטרופורציה יעילה לסינון של ארבע ישויות שונות של מערכת העיכול באמצעות פלמידים גדולים יותר (בהיקף של 10 kB). זה יכול להתבצע בתוך יום אחד ולא צריך הכנה מקיפה או מיוחד, מאגרי אלקטרופורציה אינטנסיבית בעלות.
אלקטרופורציה היא שיטה נפוצה עבור העברה עם סוגים שונים של מולקולות על ידי חדירות החשמל של קרום הפלזמה. עם השימוש הגוברת של אורגנואידים כשיטת culturing עבור חומר החולה העיקרי בשנים האחרונות, שיטות העברה יעילה של רכיבים עבור הנדסה גנטית במערכת התרבות התלת-ממדית הזאת הם זקוקים. במיוחד עבור אורגנואידים, היעילות של המניפולציות הגנטיות תלויה בזיהום מוצלח. לפיכך, פרוטוקול זה פותח כדי להקל על האלקטרופורנואידים של הארגון ולהוכיח את הפונקציונאליות האוניברסלית ביישויות שונות. המעי הגס האנושי, הלבלב, סרטן הכבד והקיבה אורגנואידים היו electroporated בהצלחה עם פלמידים קטנים וגדולים בהשוואה. בהתבסס על וקטורים קידוד GFP, היעילות של הזיהום נקבע על ידי FACS. אין צורך בהכנה מקיפה של תאים או מאגרי אלקטרופורציה מיוחדים בעלות אינטנסיבית, וניתן לבצע את הפרוטוקול תוך יום אחד.
בשנים האחרונות, הרומן 3D מערכת תרבות התא, כינה אורגנואידים, פותחה עבור רקמות נורמלי וסרטני שונים. אורגנואידים הם מבחינה פונקציונלית ומורפולוגית קרוב מאוד רקמת המקור שלהם. הם יכולים להיווצר ממינים שונים, ניתן להרחבה בקלות, genomically יציבה מבחינה גנטית, מה שהופך אותם מערכת מודל אידיאלי עבור חקירות גנטיות1,2,3. טכניקות הנדסה גנטית כמו CRISPR (מקובצים באשכולות באופן סדיר בטווח הקצר הרחב החוצה)/Cas9 מערכת לאפשר מניפולציות מגוונות. הבחירה של שיבוטים ניתן להבין על ידי תנאי מדיה מוגדרים, למשל, על ידי wnt ליגנד משיכה עבור APC (אדנומטורומטוזיס polyposis Coli) שיבוטים הנוקאאוט4,5. לחילופין, סמני בחירה צריך להיות מוצג על ידי תיקון הומוולוגי בבימויו של וקטור המיקוד6,7. בשל העובדה שלעתים קרובות צריך להציג יותר מפלסמיד אחד, העברה יעילה הופכת לפרמטר מכריע. בנוסף, כדי להפחית את ההשפעות שאינן ספציפיות ליעד, ביטוי חולף של Cas9 endonuclease הואשמונהרצוי.
אלקטרופורציה היא שיטה פשוטה יחסית לתאי transfect עם דנ א, RNA, חלבונים או קרו אחרים. באמצעות פולסים חשמליים, קרום התא הופך חדיר יותר וגורם ספיגה מוגברת9. בפרוטוקול אלקטרופורציה שפורסם בעבר של המעי הגס ביעילות של 30% עם מחזיר פיגי gfp (חלבון פלורסנט ירוק) הבעת וקטור (7.4 kB) הגיע בהליך ארבעה ימים10. הפרוטוקול הבא פותחה כדי להקל על התפתחות יעילה של סרטן או אורגנואידים בריאים עם קידוד גדול פלמידים עבור מדריך יחיד RNA (sgRNA) ו Cas9 endonuclease רצף (למשל px458 כמו וקטור עם 9.3 kb). תהליך האלקטרופורציה כולו ניתן לבצע בתוך יום אחד, ללא מאגרי אלקטרופורציה מיוחדים, עם יעילות דומה לפחות בין אורגנואידים שונים של מערכת העיכול, כלומר אדנוקרצינומה הלבלב דוטל (PDAC), סרטן המעי הגס (CRC), האקאנגיוקרצינומה (CCC) ו סרטן קיבה (GC) אורגנואידים.
פרוטוקול זה מעניק הוראות מפורטות לביצוע אלקטרופורציה יעילה, מהירה וקלה של ישויות שונות של אורגנואיד. נוסף לאורגנואידים הגידול המוצגים מ PDAC, CRC, CCC ו-GC, זה עובד בהצלחה עבור אורגנואידים נגזר מרקמות בריאות כמו גם. ניתן לבצע את הפרוטוקול בתוך יום אחד. בפרוטוקולים שפורסמו מחדש הנוהל כולו נמשך ארבעה ימים, כולל יומיים של הכנות עם סוגים שונים של טיפוח-תרגול10,21. בפרוטוקול שלנו אין צורך בטיפול מיוחד. על ידי שטיפת מאגר אלקטרופורציה לפני אלקטרופורציה הרכיבים האנטיביוטיים של המדיה נשטפו החוצה והתאמה של ריכוזי מלוחים עבור ערכי עכבה אופטימלית הושגה. עם זאת, יש לשקול מספר היבטים קריטיים עבור אלקטרופורציה מוצלחת:
תאים
בפרוטוקול אלקטרופורציה על ידי fujii ואח ‘10 מומלץ לנתק אורגנואידים לתאים בודדים כדי לסנן אותם באמצעות מסננת תא 20 יקרומטר. בידינו העיכול לתאים בודדים מקטין בחוזקה את שרידות התאים. כפי שהוצע ב Merenda et al.21, אנחנו גם הנתק אורגנואידים לאשכולות של 10-15 תאים ולא היתה אפשרות לקבוע יעילות מופחת לעומת דיסוציאציה תא בודד. לאחר electroporation, זה צעד חשוב מאוד כדי לנתק את קצף לבן, כך לא תאים מחוברים מתחילים לאיבוד.
עבור תרבות התא 2D, זה הוכח כי זמן התחדשות לאחר אלקטרופורציה של יותר מ 10 דקות עד 40 דקות מגביר את יעילות ההישרדות והיכולת לשנות במיוחד פלמידים גדולים22. בניסויים בניסוי, אותו יכול להיות מתועד עבור אורגנואידים, המוביל צעד דגירה של 40 דקות לאחר האלקטרופורציה בפרוטוקול זה. כדי להגביר את ההחלמה מהאלקטרופורציה, אנו מתורבתים אותם בעזרת החלבון המקושר Rho (ROCK) מעכב Y-27632 במשך חמישה עד שבעה ימים23. באופן דומה, תוספת נוספת של הגליקוגן סינתז ‘ ה 3 (GSK3) מעכב CHIR99021 נועד לעזור לתאים בודדים כדי לשחזר10.
גדרות
אחד היתרונות של electroporator משומשים הוא כי העכבה ניתן למדוד לפני אלקטרופורציה לתנאים אופטימליים. על פי היצרן, ערכי העכבה צריך להיות 30-55 Ω. בידינו, ערכי העכבה של 30-40 Ω הראו יעילות אופטימלית. בניסוי מקדמי, מתח שונה וערכי אורך הדופק של הדופק צפיה היו שונים כדי למצוא את החלק האופטימלי של יעילות להישרדות. לסיכום, אנו יכולים לאשר את הערכים המתוארים של Fujii ואח ‘10 ביישויות שונות המתוארות כאן.
DNA
ההשפעה של כמויות DNA שונות נבדק בניסויים ראשוניים עד 45 μg של DNA לכל מדגם. לא ניתן לזהות אפקטים ציטוטוקסיים. יעילות החצייה הוגדלה בצורה תלוית מינון עם רוויה > 30 μg. אז, השתמשנו 30 μg לכל מדגם בפרוטוקול הסופי, אבל כמובן שזה יכול להיות מוגבר (למשל, עבור האלקטרופורציה של יותר פלמידים במקביל). בנוסף, הטוהר והריכוז של הדנ א נראה מאוד חשוב. ריכוז העולה על 5 μg/μL הראה יעילות מרבית של הזיהום האופטימלי.
כצפוי, הפלמיד 9.3 kB יכול להיות מנוכר עם יעילות נמוכה יותר מאשר הקטן 4.2 kB פלמיד (ראה איור 4). השימוש בפלמידים הגדול אפילו יותר מ-10 kB צפוי להקטין עוד יותר את היעילות. עבור יישומים עתידיים, זה יכול להיות מעניין כדי לבדוק את ה-DNA של מיני מונית כמו וקטור, מאז אלה נושאות גנים חסר עמוד השדרה חיידקי של פלבאמצע שהופך אותם קטנים24. הדבר יגרום ליעילות מוגברת של הזיהום. יתר על כן, עבור CRISPR מבוססי מניפולציות של אורגנואידים אלקטרופורציה ישירה של sgRNAs כרוך Cas9 כמו ribonucleoprotein (RNP) מתחם יכול להיות חלופה או תוספת25.
The authors have nothing to disclose.
אנחנו מודים לג פוחגרוב, אן-כריסטוף. ומקס היידוק לסיוע טכני מעולה המימון סופק על ידי דויטשה קרבשילוב (No 111350 ו 70112925), סנדר Stiftung (No 2014.104.1), הקטור Stiftung (No M 65.2) והאיחוד האירופי (ERC No 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |