Questo protocollo descrive un metodo di elettroporazione efficiente per la trasfezione di quattro diverse entità organoidi gastrointestinali con plasmidi più grandi (nella misura di 10 kB). Può essere eseguito entro un giorno e non ha bisogno di una preparazione completa o di speciali tamponi di elettroporazione ad alta intensità di costi.
L’elettroporazione è un metodo comune per la trasfezione con diversi tipi di molecole per permeabilizzazione elettrica della membrana plasmatica. Con l’uso crescente di organoidi come metodo di coltura per il materiale primario del paziente negli ultimi anni, sono necessari metodi di trasferimento efficienti dei componenti per l’ingegneria genetica in questo sistema di coltura 3D. Soprattutto per gli organoidi, l’efficienza delle manipolazioni genetiche dipende da una trasfezione di successo. Così, questo protocollo è stato sviluppato per facilitare l’elettroporazione degli organoidi e per dimostrare la sua funzionalità universale in entità diverse. Gli organoidi del cancro umano colorettale, pancreatico, epatico e gastrico sono stati elettropolati con successo con plasmidi piccoli e grandi in confronto. Sulla base dei vettori di codifica GFP, l’efficienza della trasfezione è stata determinata dal FACS. Non è necessaria una preparazione completa delle cellule o buffer di elettroporazione speciali e dispendiosi in termini di costi e il protocollo può essere eseguito entro un giorno.
Negli ultimi anni, un nuovo sistema di coltura cellulare 3D, chiamato organoidi, è stato sviluppato per vari tessuti normali e cancerosi. Gli organiidi sono funzionalmente e morfologicamente molto vicini al loro tessuto di origine. Possono essere generati da diverse specie, sono facilmente espandibili, genomicamente stabili e geneticamente modificabili, il che li rende un sistema modello ideale per le indagini genetiche1,2,3. Tecniche di ingegneria genetica come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 consentono manipolazioni diverse. La selezione dei cloni può essere realizzata da condizioni multimediali definite, ad esempio, da WNT ligand ritiro per APC (Adenomatosis Polyposis Coli) cloni knockout4,5. In alternativa, i marcatori di selezione devono essere introdotti mediante la riparazione diretta omologa di un vettore di targeting6,7. A causa del fatto che spesso più di un plasmide deve essere introdotto, una trasfezione efficiente diventa un parametro cruciale. Inoltre, per ridurre gli effetti fuori bersaglio non specifici, è auspicabile un’espressione transitoria dell’endonuclease Cas98.
L’elettroporazione è un metodo relativamente semplice per trasfecare le cellule con DNA, RNA, proteine o altre macromolecole. Per mezzo di impulsi elettrici, la membrana cellulare diventa più permeabile e provoca un aumento dell’assorbimento9. In un protocollo di elettroporazione pubblicato in precedenza di organoidi del colon è stata raggiunta una efficienza del 30 % con una GFP (proteina fluorescente verde) che esprime vettore (7,4 kB) in una procedura di quattro giorni10. Il seguente protocollo è stato sviluppato per facilitare una trasfezione efficiente di organoidi cancerosi o sani con codifica di plasmidi di grandi dimensioni per l’RNA a guida singola (sgRNA) e la sequenza endonuclease Cas9 (ad esempio px458 come vettore con 9,3 kb). L’intero processo di elettroporazione può essere eseguito entro un giorno, senza speciali tamponi di elettroporazione e con efficienze almeno comparabili tra diversi gastrointestinali, vale a dire adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), cancro colorettale (CRC), colangiocarcinoma (CCC) e organoidi gastrico (GC).
Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per un elettroporazione efficiente, rapida e facile da eseguire di diverse entità organoidi. Oltre agli organoidi tumorali presentati da PDAC, CRC, CCC e GC, funziona con successo anche per gli organoidi derivati da tessuti sani. Il protocollo può essere eseguito entro un giorno. Nei protocolli di trasfezione organoide pubblicati l’intera procedura è durata quattro giorni, compresi due giorni di preparazione con diversi tipi di supporti di coltivazione10,21. Nel nostro protocollo non è richiesto alcun pretrattamento speciale. Con il lavaggio con buffer di elettroporazione prima dell’elettroporazione i componenti antibiotici dei supporti sono stati lavati ed è stata raggiunta una regolazione delle concentrazioni saline per ottenere valori di impedimento ottimali. Tuttavia, alcuni aspetti critici dovrebbero essere considerati per un elettroporazione di successo:
Cellule
Nel protocollo di elettroporazione di Fujii et al.10 si raccomanda di dissociare gli organoidi su singole cellule e di filtrarli attraverso un colino cellulare di 20 m. Nelle nostre mani la digestione in singole cellule diminuisce fortemente la sopravvivenza delle cellule. Come suggerito in Merenda et al.21, abbiamo anche dissociato organoidi a cluster di 10-15 cellule e non abbiamo potuto determinare una diminuzione dell’efficienza rispetto alla dissociazione a singola cellula. Dopo l’elettroporazione, è un passo molto importante per dissociare la schiuma bianca, in modo che nessuna cella collegata si perda.
Per la coltura cellulare 2D, è stato dimostrato che un tempo di rigenerazione dopo l’elettroporazione di oltre 10 min fino a 40 min aumenta la sopravvivenza e l’efficienza della trasfezione soprattutto di grandi plasmidi22. Negli esperimenti di prova, lo stesso potrebbe essere documentato per gli organoidi, portando ad una fase di incubazione di 40 min dopo l’elettroporazione in questo protocollo. Al fine di aumentare il recupero dall’elettroporazione, li abbiamo coltivati con l’inibitore della proteina Rho (ROCK) Y-27632 per cinque-sette giorni23. Allo stesso modo, il completamento aggiuntivo di sintetizzata glicogeno chinasi 3 (GSK3) inibitore CHIR99021 è destinato ad aiutare singole cellule a recuperare10.
Impostazioni
Uno dei vantaggi dell’elettroporatore usato è che l’impedimento può essere misurato prima dell’elettroporazione per condizioni ottimali. Secondo il produttore, i valori di impeditto dovrebbero essere 30-55 . Nelle nostre mani, ivalori di impedizione di 30-40 gradi hanno mostrato efficienze ottimali. In un esperimento preliminare, diverse tensioni e valori di lunghezza dell’impulso dell’impulso di poring sono stati variati per trovare la proporzione ottimale di efficienza alla sopravvivenza. In sintesi, potremmo confermare i valori descritti di Fujii et al.10 nelle diverse entità descritte qui.
Dna
L’effetto di diverse quantità di DNA è stato testato in esperimenti preliminari fino a 45 g di DNA per campione. Non è stato possibile rilevare effetti citotossici. L’efficienza della trasfezione è stata aumentata in modo dipendente dalla dose con saturazione > 30 g. Quindi, abbiamo usato 30 g per campione nel protocollo finale, ma ovviamente può essere aumentato (ad esempio, per l’elettroporazione di più plasmidi in parallelo). Inoltre, la purezza e la concentrazione del DNA sembra essere molto importante. Una concentrazione superiore a 5 g/l ha mostrato un’efficienza di trafezione ottimale.
Come previsto, il plasmide da 9,3 kB potrebbe essere trasinfezione con un’efficienza inferiore rispetto al plasmide più piccolo di 4,2 kB (vedere la figura 4). Si prevede che l’uso di plasmidi ancora più grandi di 10 kB riduca ulteriormente l’efficienza. Per le applicazioni future, potrebbe essere interessante testare il DNA dei minicerchi come vettore, poiché questi portatori genici non hanno la spina dorsale batterica di un plasmide che li rende più piccolidi 24. Questo dovrebbe comportare una maggiore efficienza di trasfezione. Inoltre, per le manipolazioni degli organoidi a base CRISPR, un elettroporazione diretta di sgRNA legati a Cas9 come complesso di ribonucleoproteina (RNP) potrebbe essere un’alternativa o un’aggiuntadi 25.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke e Max Heiduk per un’eccellente assistenza tecnica. I finanziamenti sono stati erogati da Deutsche Krebshilfe (n. 111350 e 70112925), Sander Stiftung (n. 2014.104.1), Hector Stiftung (n. M65.2) e l’Unione europea (ERC n. 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |