Summary
Il seguente manoscritto descrive un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema biologico di feedback neurale a circuito chiuso chiamato interfaccia nervo periferica rigenerativa composita (C-RPNI). Questo costrutto ha la capacità di integrarsi con i nervi periferici per amplificare i segnali motori efferenti, fornendo allo stesso tempo un feedback sensoriale afferente.
Abstract
Recenti progressi nella neuroprotesi hanno permesso a coloro che vivono con perdita di estremità di riprodurre molte funzioni native all'estremità assente, e questo è spesso realizzato attraverso l'integrazione con il sistema nervoso periferico. Purtroppo, i metodi attualmente impiegati sono spesso associati a danni significativi ai tessuti che impediscono un uso prolungato. Inoltre, questi dispositivi spesso mancano di alcun grado significativo di feedback sensoriale in quanto la loro costruzione complessa smorza eventuali vibrazioni o altre sensazioni da cui un utente potrebbe aver precedentemente dipeso quando utilizza protesi più semplici. L'interfaccia nervo periferica rigenerativa composita (C-RPNI) è stata sviluppata come costrutto biologico stabile con la capacità di amplificare i segnali nervomotori efferenti, fornendo al contempo un feedback sensoriale afferente simultaneo. Il C-RPNI è costituito da un segmento di innesto dermico e muscolare libero fissato intorno a un bersaglio nervoso sensoriale misto, con reinnervazione del nervo motorio preferenziale dell'innesto muscolare e reinnervazione del nervo sensoriale dell'innesto dermico. Nei ratti, questo costrutto ha dimostrato la generazione di potenziali di azione muscolare composti (CMAP), amplificando il segnale del nervo bersaglio dal livello di micro- mill-volt, con rapporti segnale-rumore in media circa 30-50. La stimolazione del componente dermico del costrutto genera potenziali composti di azione nervosa sensoriale (CSTR) al nervo prossimale. Come tale, questo costrutto ha promesso utilità futura verso la realizzazione della protesi ideale e intuitiva.
Introduction
Le amputazioni dell'estremità interessano quasi 1 su 190 americani1e si prevede che la loro prevalenza aumenterà da 1,6 milioni attuali a oltre 3,6 milioni entro il 20502. Nonostante l'uso documentato per oltre un millennio, la protesi ideale deve ancora essere realizzata3. Attualmente, esistono protesi complesse in grado di molteplici manipolazioni articolari con il potenziale di riprodurre molte funzioni motorie dell'estremità nativa4,5. Tuttavia, questi dispositivi non sono considerati intuitivi in quanto il movimento protesico desiderato è in genere funzionalmente separato dal segnale di controllo di ingresso. Gli utenti in genere considerano queste "protesi avanzate" difficili da imparare e quindi non adatte per l'uso quotidiano1,6. Inoltre, protesi complesse attualmente sul mercato non forniscono alcun grado apprezzabile di sottile feedback sensoriale per un controllo adeguato. Il senso del tatto e della propriocezione sono fondamentali per svolgere le attività quotidiane, e senza questi, semplici atti come raccogliere una tazza di caffè diventano gravosi in quanto si basa interamente su segnali visivi7,8,9. Per questi motivi, le protesi avanzate sono associate a un significativo grado di stanchezza mentale e sono spesso descritte come gravose e insoddisfacenti5,10,11. Per affrontare questo problema, alcuni laboratori di ricerca hanno sviluppato protesi in grado di fornire un limitato grado di feedback sensoriale tramite interazione neurale diretta12,13,14,15, ma il feedback è spesso limitato a piccole aree sparse sulle mani e sulle dita12,13, e le sensazioni sono state notate per essere dolorose e innaturali a volte15. Molti di questi studi purtroppo mancano di un notevole follow-up a lungo termine e dell'istologia dei nervi per delineare gli effetti dei tessuti locali, notando al contempo il fallimento dell'interfaccia sulla scala da settimane a mesi16.
Per questa popolazione, il dispositivo protesico ideale fornirebbe un controllo motorio ad alta fedeltà insieme a un feedback somatosensoriale significativo dall'ambiente dell'individuo per tutta la vita. Critico per la progettazione di tale protesi ideale è lo sviluppo di un'interfaccia stabile e affidabile che consentirebbe la trasmissione simultanea di informazioni somatosensoriali afferenti con segnali motori efferenti. Le attuali interfacce uomo-macchina sono quelle che interagiscono direttamente con il sistema nervoso periferico, e i recenti sviluppi nel campo delle protesi neuro-integrate hanno lavorato per colmare il divario tra segnali bioelettrici e meccanici17. Le interfacce attuali utilizzate includono: piastre nervose flessibili14,15,18, colidi anti-neuralielettrodi 13,19,20,21,22,23, elettrodi penetranti di tessuto24,25,31,32, ed elettrodi intrafascicolari26,27 ,28. Tuttavia, ognuno di questi metodi ha dimostrato limitazioni per quanto riguarda la specificità del nervo, lesione dei tessuti, la degenerazione assonale, l'esaurimento della mielina e/o la formazione di tessuto cicatriziale associati alla risposta cronica del corpo estraneo16,17,18,19. Più recentemente, è stato ipotizzato che un fattore alla base dell'eventuale insufficienza degli elettrodi impiantati sia la differenza significativa nella modulizzazione di Young tra materiale elettronico e tessuto neurale nativo. Il tessuto cerebrale è soggetto a micromozione significativa su base giornaliera, ed è stato teorizzato che lo stress da taglio indotto dalle differenze nella forma di Young provoca infiammazione ed eventuali cicatrici permanenti30,31,32. Questo effetto è spesso aggravato nelle estremità, dove i nervi periferici sono soggetti sia alla micromozione fisiologica che alla macromozione intenzionale dell'estremità. A causa di questo movimento costante, è ragionevole concludere che l'utilizzo di un'interfaccia nervosa periferica completamente abiotica non è l'ideale, e un'interfaccia con una componente biologica sarebbe più adatta.
Per rispondere a questa necessità di una componente biologica, il nostro laboratorio ha sviluppato un'interfaccia nervosa biotica definita Regenerative Peripheral Nerve Interface (RPNI) per integrare i nervi periferici transecpati in un arto residuo con un dispositivo protesico. La fabbricazione di RPNI comporta l'impiantazione chirurgica di un nervo periferico in un innesto muscolare muscolare libero autologo, che successivamente si riscolla e reinnervanti. Il nostro laboratorio ha sviluppato questa interfaccia nervosa biologica negli ultimi dieci anni, con successo nell'amplificare e trasmettere segnali motori quando combinato con elettrodi impiantati in prove sia animali che umane, consentendo un adeguato controllo protesico con molteplici gradi di libertà2,34. Inoltre, abbiamo dimostrato separatamente il feedback sensoriale attraverso l'uso di nervi periferici incorporati in innesti dermici, chiamato Dermal Sensory Interface (DSI)3,35. Nelle amputazioni più distali, l'utilizzo simultaneo di questi costrutti è fattibile in quanto i fascicoli motori e sensoriali all'interno del nervo periferico bersaglio possono essere separati chirurgicamente. Tuttavia, per amputazioni di livello più prossimale, questo non è fattibile a causa della mescolanza di fibre motorie e sensoriali. La Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) è stata sviluppata per amputazioni più prossimali, e comporta l'impiantamento di un nervo sensoriale-motorio misto in un costrutto costituito da innesto muscolare libero fissato ad un segmento di innesto dermico (Figura 1). I nervi periferici dimostrano una reinnervazione mirata preferenziale, quindi le fibre sensoriali riinnerizzeranno l'innesto dermico e le fibre motorie, l'innesto muscolare. Questo costrutto ha così la capacità di amplificare contemporaneamente i segnali motori fornendo un feedback somatosensoriale36 (Figura 2),consentendo la realizzazione della protesi ideale, intuitiva e complessa.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti sotto l'approvazione del Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan.
NOTA: ai ratti donatori è consentito l'accesso gratuito al cibo e all'acqua prima delle procedure di donazione di pelle e muscoli. L'eutanasia viene eseguita in anestesia profonda seguita da iniezione di cloruro di potassio intra-cardiaco con un metodo secondario di pneumotorace bilaterale. Qualsiasi ceppo di ratto può teoricamente essere utilizzato con questo esperimento; tuttavia, il nostro laboratorio ha ottenuto risultati costanti sia nei ratti Fischer F344 maschi che femmine (200-250 g) a due o quattro mesi di età. I ratti donatori devono essere isogeni ai ratti sperimentali.
1. Preparazione dell'innesto dermico
- Anestesizzare il ratto donatore in una camera di induzione utilizzando una soluzione del 5% di isoflurane in ossigeno a 0,8-1 L/min. Una volta che il ratto è stato anestesizzato, rimuovere dalla camera di induzione e posizionare su un cono naso respirante, abbassando l'isoflurane al 2-2,5% per il mantenimento dell'anestesia.
- Somministrare una soluzione di Carprofen (50 mg/mL) di 0,2 mL di solina salina sterile sottocutaneamente tra le scapole per l'analgesia.
- Applicare unguento lacrime artificiali su entrambi gli occhi per prevenire ulcere corneali.
- Utilizzando i clipper, radete l'intero arto posteriore inferiore, la regione della caviglia e i lati delle zampe.
- Pulire l'arto posteriore scelto e la superficie plantare della zampa con l'alcol, seguita da soluzione iodopovidone, terminando con una pulizia finale con alcool per rimuovere lo iodopovidone residuo.
- Utilizzando un trapano ad alta velocità per micromotore portatile con una pietra di lucidatura a grana fine rotonda rimovibile (4000 rpm), burrare la superficie plantare della zampa per rimuovere l'epidermide. Durante la baviera, applicare gocce di salina per non bruciare la pelle. Il derma sottostante avrà un aspetto lucido con sanguinamento individuato.
- Applicare un laccio emostatico all'estremità inferiore per rallentare il flusso sanguigno.
- Rimuovere bruscamente la pelle plantare con un #15 bisturi e mettere in garza salina-umida per prevenire la disidratazione. Alcuni tessuti tendino sinosa e connettivo saranno intrinsecamente rimossi con la pelle in questo passaggio e saranno rimossi in seguito.
- Applicare l'involucro di garza sul piede sanguinante per rallentare l'emorragia. Ripetere i passaggi da 1.5-1.9 se si esegue due costrutti.
- Sotto un microscopio (20 volte l'ingrandimento), rimuovere il tessuto tendino sosia e connettivo dallo strato profondo dell'innesto cutaneo utilizzando micro-forbici. Fare attenzione a non fare buchi nell'innesto. L'innesto dermico assottigliato deve essere leggermente opaco contenente solo derma, misurando circa 0,5 cm x 1,0 cm di dimensione.
- Mettere in garza salina-umida fino a quando pronto per C-RPNI costruire la fabbricazione. Gli innesti devono essere utilizzati entro 2 ore dal raccolto.
2. Preparazione dell'innesto muscolare
- Fare un'incisione longitudinale lungo l'aspetto anteriore dell'arto posteriore inferiore da appena sopra la caviglia a appena sotto il ginocchio con un #15 bisturi. Disseta attraverso il tessuto sottocutaneo per esporre la muscolatura sottostante.
- All'aspetto distale dell'incisione, esporre gli inserimenti tendino della muscolatura degli arti inferiori. Tibialis anterior (TA) è tipicamente il più grande e più anteriore dei muscoli, e appena sotto e posteriore a questo muscolo si trova l'estensore digitorum longus (EDL). Isolare il tendine EDL distale dagli altri tendini della zona, facendo attenzione a non incise il suo inserimento in questo punto.
- Garantire l'isolamento del tendine corretto inserendo entrambe le tine di una forza sotto il tendine ed esercitando una pressione verso l'alto aprendo le pinze per causare escursione tendina. Manipolazione di questo tendine dovrebbe causare tutte le diciture per estendere contemporaneamente.
- Eseguire una tenotomia distale con forbici aride e separare il muscolo dai tessuti circostanti senza mezzi termini con tenotomie (o altre forbici con punta smussata) lavorando proporzionalmente per trovare l'origine tendinosa.
- Una volta visualizzato il tendine prossimale, eseguire nuovamente una tenotomia utilizzando forbici acute. Mettere l'innesto muscolare in una garza salina-inumidita per prevenire la disidratazione.
- Una volta che tutti gli innesti desiderati sono stati rimossi da un ratto donatore, eutanasia principalmente per iniezione intra-cardiaca di KCl (1-2 mEq K/kg) seguito da eutanasia secondaria con pneumothorax foratura bilaterale con una lama #15.
3. Isolamento e preparazione del nervo peroneale comune
- Anestesia e fornire analgesia al ratto sperimentale secondo il protocollo descritto nei passaggi 1.1-1.3.
- Rasare la coscia desiderata e pulire con alcool, betadine, terminando con l'alcol per rimuovere le tracce di betadine.
- Spostare l'animale dalla tabella di preparazione chirurgica al tavolo chirurgico al microscopio e posizionarlo sul pad di riscaldamento con sonda di temperatura per il mantenimento della temperatura corporea. Mantenere l'isoflurane al 2-2,5% e l'ossigeno a 0,8-1 L/min.
- Contrassegnare l'incisione, che si estende da appena distale a tacca sciatica alla parte inferiore del ginocchio. Questa marcatura deve essere inferiore e inclinata lontano dal femore. Fare l'incisione con una lama #15 incisivo attraverso il bicipite sottostante femoris fascia.
- Sezionate con cura attraverso il muscolo bicipiti femoris con un emotologo o microforbici con punta smussata nello spazio sottostante bicipiti femoris.
NOTA: Il nervo sciatico viaggia approssimativamente nella stessa direzione dell'incisione iniziale che è stata fatta. Ci sono tre rami, tipicamente con nervo salare posteriore e comune nervo peroneale e tibiale che viaggiano superficiale e profondo al ginocchio, rispettivamente. - Dopo l'identificazione del nervo peroneale comune (CP), utilizzando un paio di pinze micro-, con punta fine e micro-forbici, isolare attentamente il nervo CP dagli altri rami sciatici e rimuovere qualsiasi distally del tessuto connettivo persistente.
- Nel punto in cui il nervo attraversa la superficie del ginocchio, transeggiare bruscamente il nervo con un paio di micro-forbici.
NOTA: L'uso di forbici affilate è estremamente importante in questa fase in quanto causare traumi significativi al nervo potrebbe aumentare il rischio di formazione di neuroma. - Liberare con cura qualsiasi tessuto connettivo rimanente dal nervo CP e lavorare in modo approssimativo per liberare il nervo a una lunghezza di circa 2 cm.
4. Fabbricazione costrutto Costrutto C-RPNI
- Rimuovere l'innesto muscolare dalla garza salina-umida e rimuovere tutto il tessuto tendinoso centrale, nonché un piccolo segmento centrale di epimysium. Lasciare intatte le estremità tendine.
- Utilizzando un 8-0 sutura di nylon, fissare l'epineurium dell'estremità transeclata del nervo CP all'area dell'innesto muscolare priva di epimysio con due punti interrotti su entrambi i lati del nervo.
- Fissare l'innesto muscolare al periosteo del femore con un singolo punto interrotto di nylon 6-0 sia a livello proximo che distatuante con la giunzione nervo-muscolare rivolta lontano dal femore.
NOTA: Fissare il muscolo in modo che sia a normale lunghezza rilassata. Cercate di non allungare il muscolo in modo significativo o lasciare troppo lassismo durante la sicurezza. - Posizionare un 8-0 punto di nylon al margine centrale inferiore dell'epimysio dell'innesto muscolare, fissandolo all'epineurio del nervo CP in modo da creare lassità nel nervo all'interno dell'innesto muscolare e contribuire ad alleviare qualsiasi tensione futura a cui può essere esposto con successiva ambulation.
- Rimuovere l'innesto cutaneo dalla garza salina-umida e disporlo sull'innesto muscolare in modo tale da coprire completamente il nervo e la maggior parte del muscolo. Assicurarsi che il margine profondo del derma sia appoggiato sul muscolo. Tagliare qualsiasi derma che si estende oltre il bordo del muscolo.
- Fissare l'innesto cutaneo all'innesto muscolare circonferenzalmente con 8-0 suture interrotte in nylon. In genere, vengono utilizzate 4-8 suture totali a seconda delle dimensioni del costrutto.
- Chiudere la fascia bicipite femoris sopra il costrutto in modo da corsa con 5-0 sutura cromica.
- Chiudere la pelle sovrastante con 4-0 sutura cromica in modo da correre.
- Swab l'area chirurgica con un alcoltto e applicare unguento antibiotico.
- Cessate l'anestesia inalazionale e permettete al ratto di recuperare con cibo e fonti d'acqua separate dai compagni di gabbia.
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Representative Results
La fabbricazione del costrutto è considerata infruttuosa se i ratti sviluppano un'infezione o non sopravvivono all'anestesia chirurgica. Ricerche precedenti hanno indicato che questi costrutti richiedono circa tre mesi per riscolitare e reinnervare2,3,17,36. Dopo il periodo di recupero di tre mesi, è possibile eseguire il test di costruzione per esaminare la fattibilità. L'esposizione chirurgica dei costrutti dopo tre mesi rivelerà il muscolo e la pelle rivascolarizzati se hanno successo (Figura 3). A volte, l'innesto muscolare libero e dermico può consistere esclusivamente di tessuto cicatriziale e/o il nervo non sarà attaccato al costrutto; questi risultati indicano un tentativo non riuscito. Tuttavia, se ha successo, spremitura delicata del nervo peroneale comune con pinze prossimali al costrutto si tradurrà in contrazione muscolare visibile (Video 1). L'analisi istologica dei costrutti dovrebbe dimostrare la pelle, il nervo e il muscolo vitali (Figura 4). L'immunostaining rivelerà anche la reinnervazione del nervo motorio e sensoriale alle loro giunzioni neuromuscolari e agli organi finali sensoriali, rispettivamente (Figura 5). Se il nervo peroneale comune non reinnerta quei tessuti, l'immunostaining non dimostrerà alcuna singola fibra nervosa all'interno del costrutto, ad eccezione del nervo impiantato stesso.
I test elettrofisiologici possono essere eseguiti su questi costrutti in vivo (Figura 6); ricerche precedenti sono state condotte a 3 e 9 mesi dopo la fabbricazione di C-RPNI36 (tabella 1). A seguito di stimolazione massima con un elettrodo di gancio al nervo peroneso comune prossimale appena distale al suo decollo dal nervo sciatico, i potenziali di azione muscolare composta (CMAP) possono essere misurati al componente muscolare con contrazione muscolare visibile. Il tipo di elettrodo utilizzato al muscolo può variare in base alle preferenze, ma patch epimysiale, pad epimysiale, ed elettrodi sonda bipolare sono stati utilizzati con successo in questa ricerca. L'ampiezza media CMAP registrata al muscolo è stata di 8,7 x 1,6 mV a 3 mesi e 10,2 x 2,1 mV a 9 mesi. La velocità media di conduzione era di 10 x 1,2 m/s a 3 mesi e 9,5 x 0,6 m/s a 9 mesi. In confronto, CMAP generati dal muscolo edL fisiologico in genere vanno da 10-18 mV37. In seguito alla stimolazione presso la componente dermica del C-RPNI, i potenziali di azione nervosita sensoriale composti (CNP) sono stati prodotti al nervo peroneale comune prossimale, con un'ampiezza media CSNAP di 113,7 x 35,1 V a 3 mesi e 142,9 x 63,7 V a 9 mesi. La figura 7 illustra i segnali CMAP e CSNAP singoli e sommati ottenuti durante i test elettrofisici in formato grafico.
Il C-RPNI serve ad amplificare il segnale di microvolt inerente di un nervo, e la ricerca precedente ha dimostrato un'amplificazione sufficiente dal microvolt al livello millivolt38. Pertanto, se un costrutto non fornisce tale livello di amplificazione, non viene considerato riuscito. Se il dermal, muscolo, o entrambi i componenti del C-RPNI fallire, test si tradurrà in registrazioni che imitano il segnale di stimolazione utilizzato. Per la componente muscolare in particolare, un risultato non ottimale (ma che è ancora considerato operativo) sarebbe uno che ha ampiezza CMAP e velocità di conduzione nella gamma che rientra tra il valore di stimolazione del segnale e quello del muscolo EDL fisiologico. Inoltre, questi segnali possono attenuarsi e non hanno la caratteristica forma d'onda CMAP (Figura 8A). Risultati non ottimali a livello del componente dermico possono verificarsi, ma sono difficili da quantificare dato che i ratti non possono esprimere la qualità della sensazione che sperimentano. Questi risultati non ottimali di solito comportano lo smorzamento della forma d'onda con rumore di fondo significativo (Figura 8B). Tuttavia, se c'è cicatrici significative o callusing dell'innesto cutaneo, o sopravviverato un innesto minimo, nessun CSNP sarà apprezzato al nervo peroneale comune prossimale indipendentemente dal valore della stimolazione.
Figura 1: schema illustrativo del costrutto C-RPNI. Il nervo peroneale comune può essere visto fissato tra lo strato dermico superiore e lo strato muscolare inferiore. Questo costrutto è fissato al femore periosteo prossimamente e distally attraverso le giunzioni tendinose di EDL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione pittorica del C-RPNI in un paziente con amputazione transradiale. L'utente forma un'intenzione motoria desiderata a livello cerebrale (ad esempio, presa di pincer), che viene trasmessa come segnale motore efferente al C-RPNI attraverso il nervo periferico impiantato. Questo segnale genera un potenziale di azione muscolare composto (CMAP) al componente muscolare, che viene registrato da elettrodi impiantati e riconosciuto dal dispositivo protesico, generando il movimento desiderato. I sensori sulla punta delle dita del dispositivo riconoscono la quantità di pressione generata e inoltrano tali informazioni a un elettrodo impiantato nel componente dermico del C-RPNI. Questi segnali attivano i corrispondenti organi finali sensoriali, generando un potenziale di azione nervosa sensoriale composto afferente (CSNAP) trasmesso attraverso il nervo periferico alla corteccia sensoriale. Un segnale di esempio generato a ciascun componente è raffigurato all'interno delle caselle blu raffigurate accanto a ciascun componente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: C-RPNI in vivo. (A) Un C-RPNI immediatamente successivo alla fabbricazione e a (B) 3 mesi dopo la costruzione al momento dei test elettrofisiologici. La componente muscolare è lo strato profondo del costrutto e il dermico, il superficiale. Il tessuto muscolare è contrassegnato da (M), derma (D) e nervo peroneale comune (N). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Istologia C-RPNI 6 mesi. C-RPNI H&E a 6 mesi in (A) sezione longitudinale e (B) sezione longitudinale. Muscolo notato da (M), derma (D) e nervo (N). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immunostaining del C-RPNI. (A) Esempio rappresentativo di una sezione trasversale del tessuto muscolare, con frecce rosse che identificano le giunzioni neuromuscolari. Un maggiore ingrandimento della giunzione neuromuscolare centrale (NMJ) è raffigurato in basso a destra. (B) Primo piano di una giunzione neuromuscolare annotato nel campione. Per (A) e (B), colorazione rossa (alfa-bungarotoxin) indica la presenza di recettori colinergici nel tessuto muscolare; blu (neurofilamento 200) specifica la presenza di neurofilamenti all'interno del tessuto neuronale; e verde (colina acetiltransferase) note specificamente presenza del motoneurone. (C) Esempio rappresentativo di un'immagine iDISCO incentrata sulla giunzione dermica, con frecce rosse che segnano neuroni sensoriali (bianchi) che entrano nel derma. (D) Vista on-lay di iDISCO dimostrando più neuroni sensoriali (bianco, neurofilamento 200). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Schema di test elettrofisiologico. L'immagine superiore è un'illustrazione della disposizione standard degli elettrodi per testare i costrutti C-RPNI. C'è un cerotto e/o un elettrodo sonda posto su entrambi i componenti muscolari e dermici del C-RPNI, con un elettrodo a doppio gancio posto al nervo peroneale comune prossimo. L'immagine in basso è un esempio in vivo della disposizione dei test su un soggetto del ratto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Segnalazione elettrofisiologica C-RPNI tipica. (A) Un singolo segnale CMAP registrato presso il componente muscolare a seguito di un segnale di 5,00 mA applicato al nervo CP. (B) 24 CAP generati da 5,00 mA stimolazione al nervo. (C) Un singolo segnale CSNAP registrato dal nervo del CP prossimale a seguito della stimolazione dei componenti dermici a 900 -A.( D ) Una serie di CNNAP registrati dal nervo CP prossimale a seguito di una stimolazione crescente presso la componente dermica da 500 a 1000 .
Figura 8: Segnalazione C-RPNI anomala. (A) Una serie di CMAP ottenuti mentre aumenta la stimolazione nervosa CP da 0,2 a 4 mA. Il picco delle forme d'onda in punti diversi e non riesce a tornare alla linea di base, indicando probabilmente elettrodi difettosi o una funzione di costruzione complessiva inadeguata. (B) Sommadei CSONi ottenuti stimolando la componente dermica, aumentando da 0,1 a 5 mA. Questi risultati possono verificarsi per una moltitudine di motivi, tra cui elettrodi malfunzionanti, innesto dermico cicatrici, e/o danni ai nervi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Dati del mese 3 | Dati CMAP (Stimulate CP nervo e registrare da innesto muscolare) | Dati CSNAP (Stimolare l'innesto cutaneo e registrare dal nervo CP) | |||||
| Numero ID ratto | Peso costrutto (g) | Amplitua stimolazione (mA) | Velocità di conduzione (m/s) | V Picco-a-Picco (mV) | Amplitua stimolazione (mA) | Velocità di conduzione (m/s) | V Picco-a-Picco (V) |
| 4607 | 0.087 | 4.17 | 11.3 | 10.3 | 18 | 11.1 | 121 |
| 4608 | 0.15 | 1.65 | 11.1 | 17.1 | 7.7 | 6.5 | 136 |
| 4611 | 0.113 | 8.3 | 9.6 | 11.2 | 10 | 10 | 121 |
| 4613 | 0.116 | 3.18 | 10 | 9.6 | 1.44 | 8.3 | 134 |
| 4614 | 0.189 | 3 | 10.8 | 9.6 | 7.39 | 9 | 151 |
| 4616 | 0.122 | 5.2 | 9.4 | 14.9 | 1.8 | 9.1 | 100 |
| 4620 | 0.118 | 2.91 | 7.6 | 7.4 | 8.7 | 10 | 219 |
| Dati di 9 mesi | Dati CMAP (Stimulate CP nervo e registrare da innesto muscolare) | Dati CSNAP (Stimolare l'innesto cutaneo e registrare dal nervo CP) | |||||
| Numero ID ratto | Peso costrutto (g) | Amplitua stimolazione (mA) | Velocità di conduzione (m/s) | V Picco-a-Picco (mV) | Amplitua stimolazione (mA) | Velocità di conduzione (m/s) | V Picco-a-Picco (V) |
| 4687 | 0.238 | 1.35 | 9.6 | 18.2 | 0.99 | 11 | 181 |
| 4688 | 0.131 | 1.08 | 10 | 8.8 | 1.11 | 8 | 132 |
| 4689 | 0.26 | 1.26 | 9.6 | 21.8 | 1.9 | 8.6 | 237 |
| 4690 | 0.192 | 4.2 | 8.3 | 12.8 | n/a | n/a | n/a |
| 4691 | 0.213 | 1.38 | 10 | 18.6 | 6.6 | 8 | 153 |
| 4693 | 0.178 | 1.11 | 9.6 | 15.1 | 8.7 | 8.3 | 306 |
Tabella 1: Test elettrofisiologici delle C-RPSI a 3 e 9 mesi dopo la costruzione. Per ottenere I CMAP, un elettrodo di registrazione è stato posizionato sul muscolo con un elettrodo stimolante sul nervo peroneale comune prossimale. Al nervo è stata applicata una serie di stimolazioni che aumentano l'ampiezza fino a quando non sono stati ottenuti valori massimi di CMAP e sono stati registrati i risultati. Una metodologia simile è stata applicata al componente dermico, ma con l'elettrodo di registrazione posto sul nervo e stimolando l'elettrodo sul derma. Per la valutazione sensoriale del ratto 4690 a 9 mesi, l'innesto dermico è risultato troppo sfregiato per consentire il test.
Video 1: Contrazione muscolare all'interno di un C-RPNI. Un paio di pinze possono essere viste a sinistra del video spremendo delicatamente il nervo peroneale comune prossimale. Questo si traduce in contrazione della componente muscolare di un C-RPNI di 3 mesi che è visibile allo spettatore. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Il C-RPNI è un nuovo costrutto che fornisce l'amplificazione simultanea dei segnali motori di un nervo bersaglio con fornitura di feedback sensoriale afferente. In particolare, il C-RPNI ha un'utilità unica per coloro che vivono con amputazioni prossimali in quanto i loro fascicoli motori e sensoriali non possono essere facilmente separati meccanicamente durante l'intervento chirurgico. Invece, il C-RPNI utilizza le proprietà di reinnervazione preferenziale intrinseche del nervo stesso per incoraggiare la reinnervazione sensoriale della fibra agli organi finali sensoriali dermici e fibre motorie alle giunzioni neuromuscolari.
Poiché la fabbricazione C-RPNI si basa sulle capacità di reinnervazione del nervo bersaglio, un'attenta manipolazione del nervo è fondamentale durante la procedura. Durante la dissezione, evitare la manipolazione diretta del nervo bersaglio e il trauma. Se il nervo deve essere maneggiato, si consiglia di manipolare invece l'epineurium o il tessuto connettivo circostante. Anche se il nostro laboratorio non ha incontrato la formazione di neuroma all'interno di questo costrutto, teoricamente, trauma nervoso significativo potrebbe aumentare il rischio. Un ulteriore passo chiave nel processo è la raccolta degli innesti dermici. Tutto il tessuto epidermico deve essere rimosso dall'innesto di zampa posteriore in quanto l'epidermide trattenuta può aumentare il rischio di infezione e cisti di inclusione durante il processo di guarigione. Inoltre, l'innesto dermico deve essere adeguatamente assottigliato per promuovere l'imbibizione e la rivascolarizzazione in tutto l'innesto ed evitare ischemia e necrosi significativi.
Anche se la maggior parte degli studi condotti con il C-RPNI sono stati eseguiti sul nervo peroneale comune, qualsiasi nervo sensomotorio misto potrebbe essere sostituito. Un nervo sensoriale puro o motorio potrebbe essere utilizzato, ma i risultati sono difficili da prevedere e probabilmente si tradurrebbero in una reinnervazione in gran parte muscolare o dermica, rispettivamente. Per quanto riguarda l'innesto muscolare, fintanto che l'epimysio viene rimosso dalla porzione di contatto con il nervo, qualsiasi innesto muscolare di dimensioni simili potrebbe essere utilizzato purché contenesse tessuto tendinooso o fasciale ad entrambe le estremità adatto per l'ancoraggio al periosteo nelle vicinanze. Per l'innesto dermico, tessuto glabro è specificamente utilizzato a causa del potenziale per la crescita dei capelli dopo l'innesto. La pelle non glavante è stata precedentemente tentata, ma a causa della difficoltà di rimuovere i singoli follicoli piliferi, tutti i costrutti risultanti hanno avuto una crescita significativa dei capelli, infiammazione e cicatrici dopo il periodo di maturazione di tre mesi. Inoltre, altre specie di ratti possono essere impiegate, ma i ratti Lewis e Fischer sono raccomandati per questo esperimento poiché molte altre specie di ratti si automutilano secondarie alla transezione nervosa39,40.
Dato il ritardo tra procedura e risultati, è difficile sapere in anticipo se è necessario fare qualche modifica al metodo. L'infezione è un rischio teorico incontrato raramente dal nostro laboratorio, ma se si verifica l'infezione, è in genere reattivo agli antibiotici. Occasionalmente, i ratti masticano le loro incisioni causando dehiscence, e questo può essere trattato con il lavaggio, il debridement e la richiusura. Se, dopo tre mesi al momento dell'esposizione, il costrutto risulta non funzionale e/o cicatrizzato, ci sono diverse cause potenziali. A volte, se il nervo non è fissato correttamente al costrutto con almeno tre suture, il nervo può strappare dal costrutto con l'ambulation. Inoltre, gli innesti muscolari e/o dermici possono essere necrosi, causando un guasto. Tipicamente, questo è il risultato di un'infezione ripetuta, l'innesto dermico è troppo spesso, o il muscolo troppo danneggiato al momento del recupero per recuperare correttamente. Inoltre, se il muscolo non è fissato al periosteo a distanza di riposo, la contrazione può essere compromessa causando segnali inadeguati durante i test. A volte, il costrutto apparirà praticabile ma non riuscirà a produrre CMAC/CMAL adeguati durante i test (5-10% dei costrutti, in media). Questo potrebbe essere secondario al guasto nelle apparecchiature, all'impedimento elevato degli elettrodi o al callusing cutaneo significativo. Il callusing cutaneo può smorzare e bloccare completamente la trasduzione del segnale se il derma non viene assottigliato correttamente durante la fabbricazione. Se uno degli eventi descritti precedenti viene visto frequentemente durante il processo di test, è necessario tornare al protocollo e apportare le modifiche appropriate. Nell'esperienza del nostro laboratorio con oltre 90 costrutti C-RPNI di successo, il nostro tasso di guasto è <5% e tipicamente attribuito a errori chirurgici durante la fabbricazione.
I metodi comunemente utilizzati per amplificare o registrare i segnali nervosi includono piastre nervose flessibili18, polsini extra-neurali elettrodi19,20 ,20,21,22,23, elettrodi penetranti di tessuto24,25,31,32, e elettrodi intrafascicolari26,27,28, tutti i quali sono stati associati con lesioni tissutali, degenerazione assonale e/o formazione di tessuto cicatriziale. Questa cicatrice è spesso attribuita alla risposta cronica del corpo estraneo29 e allo stress da taglio indotta dalle differenze nel modulo30 diYoung. Il C-RPNI, tuttavia, è un costrutto biologico e quindi non induce la risposta del corpo estraneo nel tessuto neurale. Inoltre, le sue proprietà meccaniche sono diversi fattori più vicini al tessuto neurale rispetto agli elettrodi. L'analisi istologica di questi campioni non ha dimostrato alcun grado significativo di formazione del tessuto cicatriziale nel nervo con uso cronico, consentendo così al C-RPNI di interfacciarsi con il nervo per lunghi periodi rispetto ai metodi sopra elencati. Anche se questo metodo è altamente efficace all'amplificazione dei segnali motori efferenti, è limitato per quanto riguarda la produzione sensoriale di segnale afferente. Abbiamo misurato e caratterizzato la trasduzione del segnale prodotta con stimolazione meccanica ed elettrica del componente dermico del C-RPNI36; tuttavia, questi soggetti di ratto non possono qualificare il tipo o il grado di sensazioni derivanti dalla stimolazione di questo costrutto. Come tale, in questo momento è impossibile sapere che tipo di effetto il C-RPNI sta producendo per quanto riguarda la sensazione. Le direzioni future per questo costrutto includeranno la caratterizzazione dei segnali prodotti nel nervo prossimale seguendo specifici stimoli forniti (ad esempio, calore, dolore, pressione, ecc.) e la correlazione con i potenziali evocati somatosensoriali generati nella corteccia sensoriale del cervello del roditore. L'obiettivo del nostro laboratorio è quello di stabilire una base completa per gli RPN che apriranno la strada alla traduzione clinica ai soggetti umani.
Il predecessore del C-RPNI, il RPNI (interfaccia nervo periferica rigenerativa), è costituito da un innesto muscolare libero attaccato a un nervo transected, con fibre motorire reinnervanting giunzioni neuromuscolari precedentemente denervated. L'RPNI ha dimostrato utilità in soggetti umani, con diversi pazienti che controllano protesi avanzate da segnali amplificati da-e registrati da-questi RPNIs34. Inoltre, queste RPNE hanno dimostrato effetti benefici di trattamento oltre il controllo protesico, con diversi studi retrospettivi e prospettici preliminari che mostrano una diminuzione della formazione del neuroma, dolore cronico e dolore agli arti fantasma in quei pazienti con amputazioni dell'estremità. Nonostante questi successi, una lamentela comune per coloro che utilizzano queste protesi avanzate, tuttavia, è la necessità di visualizzare la protesi durante l'uso come queste protesi mancano di proprioception e fornire un feedback sensoriale minimo. Il C-RPNI potrebbe essere una soluzione a questa critica comune, fornendo un modo per fornire feedback sensoriale tramite la componente dermica, portando alla realizzazione della tanto desiderata, protesi ideale.
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Disclosures
Gli autori non hanno divulgazioni.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Jana Moon per l'assistenza tecnica esperta. Gli studi presentati in questo documento sono stati finanziati attraverso una sovvenzione R21 (R21NS104584) a SK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scalpel | Aspen Surgical, Inc | Ref 371115 | Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15) |
| 4-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 1654G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 5-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 687G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 6-0 Ethilon Suture | Ethicon | SKU# 697G | P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture) |
| 8-0 Monofilament Suture | AROSurgical | T06A08N14-13 | Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle |
| Experimental Rats | Envigo | F344-NH-sd | Rats are Fischer F344 Strain |
| Fluriso (Isofluorane) | VetOne | 13985-528-40 | Inhalational Anesthetic |
| Micro Motor High Speed Drill with Stone | Master Mechanic | Model 151369 | Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones |
| Oxygen | Cryogenic Gases | UN1072 | Standard medical grade oxygen canisters |
| Potassium Chloride | APP Pharmaceuticals | 63323-965-20 | Injectable form, 2 mEq/mL |
| Povidone Iodine USP | MediChoice | 65517-0009-1 | 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Corneal protective ointment for use during procedure |
| Rimadyl (Caprofen) | Zoetis, Inc. | NADA# 141-199 | Injectable form, 50 mg/mL |
| Stereo Microscope | Leica | Model M60 | User can adjust magnification to their preference |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | Various | User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab |
| Triple Antibiotic Ointment | MediChoice | 39892-0830-2 | Ointment comes in sterile, disposable packets |
| VaporStick 3 | Surgivet | V7015 | Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister |
| Webcol Alcohol Prep | Coviden | Ref 6818 | Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep |
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