Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact
Summary
Le but de ce protocole est d’analyser la division cellulaire dans les tissus intacts par microscopie cellulaire vivante et fixe à l’aide de spermatocytes méiotiques Drosophila. Le protocole démontre comment isoler des testicules entiers et intacts des larves de Drosophila et des pupes précoces, et comment les traiter et les monter pour la microscopie.
Abstract
L’analyse expérimentale des cellules se divisant dans les tissus et les organes vivants et intacts est essentielle à notre compréhension de la façon dont la division cellulaire s’intègre au développement, à l’homéostasie tissulaire et aux processus de la maladie. Les spermatocytes de Drosophila subissant la méiose sont idéaux pour cette analyse parce que (1) les testicules entiers de Drosophila contenant des spermatocytes sont relativement faciles à préparer pour la microscopie, (2) la grande taille des spermatocytes les rend bien adaptés pour l’imagerie à haute résolution, et (3) les outils génétiques puissants de Drosophila peuvent être intégrés avec l’analyse in vivo. Ici, nous présentons un protocole facilement accessible pour la préparation de testicules entiers de Drosophila troisième larves instar et pupes précoces. Nous décrivons comment identifier les spermatocytes méiotiques dans les testicules entiers préparés et comment les imager en direct par microscopie en time-lapse. Des protocoles de fixation et d’immunostaining de testicules entiers sont également fournis. L’utilisation des testicules larvaires présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles disponibles qui utilisent des testicules adultes pour l’analyse des spermatocytes. Plus important encore, les testicules larvaires sont plus petits et moins encombrés avec des cellules que les testicules adultes, ce qui facilite grandement l’imagerie à haute résolution des spermatocytes. Pour démontrer ces avantages et les applications des protocoles, nous présentons des résultats montrant la redistribution du réticulum endoplasmique en ce qui concerne les microtubules fuseaux pendant la division cellulaire dans un spermatocyte simple photographié par microscopie confocale en time-lapse. Les protocoles peuvent être combinés avec l’expression d’un certain nombre de protéines marquées fluorescentes ou marqueurs d’organelle, ainsi que des mutations génétiques et d’autres outils génétiques, ce qui rend cette approche particulièrement puissante pour l’analyse des mécanismes de division cellulaire dans le contexte physiologique des tissus entiers et des organes.
Introduction
La division cellulaire est souvent étudiée à l’aide de lignées cellulaires cultivées dans la culture1. Bien que nous ayons acquis une richesse de perspicacité inestimable et la compréhension des mécanismes fondamentaux de ces études2, les cellules cultivées dans la culture ne peuvent pas entièrement récapituler la physiologie de la division cellulaire comme il se produit dans intact, tissu vivant. Par exemple, dans les tissus et les organes intacts, les cellules doivent se diviser au bon endroit et au bon moment afin que les cellules progénitrices soient correctement situées dans le tissu, de sorte qu’elles puissent subir une différenciation appropriée ou des programmes fonctionnels, et de sorte que la prolifération cellulaire soit correctement coordonnée avec la croissance des tissus ou l’homéostasie3. Pour les cellules cultivées en culture d’autre part, la division cellulaire est généralement réglementée par des facteurs de croissance dans le milieu de la culture4, et donc nous ne pouvons pas apprendre de ces cellules comment in vivo facteurs environnementaux tels que l’architecture tissulaire ou la signalisation développementale influencent le processus de division. Il est également important de noter que beaucoup de lignées cellulaires utilisées pour étudier la division cellulaire, telles que Les cellules HeLa et U2OS, ont été dérivées de tumeurs métastatiques5. Par conséquent, de nombreux aspects de la physiologie de base de ces cellules cancéreuses, tels que les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et la stabilité chromosomique, ont probablement été modifiés par rapport aux cellules saines. La compréhension complète de la physiologie de division cellulaire dépend donc de notre capacité à étudier les cellules de division dans leurs environnements indigènes in vivo qui préservent les mécanismes physiologiques de régulation et l’architecture tissulaire.
Les progrès dans la compréhension du fonctionnement de la division cellulaire dans les tissus et les organes intacts sont entravés par des difficultés inhérentes à l’analyse in vivo ou ex vivo. Tout d’abord, il peut être difficile ou impossible d’accéder à des cellules de division pour une analyse microscopique dans de grands organes ou des tissus épais. Deuxièmement, il est souvent difficile de prédire quand les cellules individuelles se divisent in vivo. Troisièmement, la physiologie tissulaire peut rapidement se détériorer pendant la culture ex vivo. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes facilement accessibles pour l’analyse vivante et fixe des spermatocytes de mélanogaster de Drosophila pendant qu’ils subissent des divisions méiotiques de cellules dans des testicules entièrement intacts. Ces cellules sont idéales pour l’analyse vivante et ex vivo parce qu’elles sont facilement accessibles avec des méthodes optiques standard telles que la microscopie confocienne, elles se divisent à des moments et des endroits prévisibles, et les testicules intacts peuvent être maintenus dans la culture ex vivo jusqu’à environ 24 h. En outre, les spermatocytes Drosophila sont de grandes cellules rondes (environ 20 à 30 m de diamètre) qui ne changent pas de forme lorsqu’elles se divisent, ce qui les rend idéales pour l’imagerie à haute résolution et en time-lapse des composants cellulaires tels que l’appareil fuseau et les organites cytoplasmiques. Bien que ces cellules subissent la méiose par opposition à la mitose, beaucoup des processus essentiels de division cellulaire sont très semblables entre ces deux mécanismes de division cellulaire6. Ces avantages, combinés avec de puissants outils génétiques Drosophila, ont fait des spermatocytes Drosophila un modèle largement utilisé pour l’analyse ex vivo des processus essentiels de division cellulaire, y compris la formation et la régulation des fuseaux, la cytokinésie, et le remodelage et le cloison d’organelle7,8,9,10,11.
Les spermatocytes sont des cellules qui sont au stade méiotique de la spermatogénèse. Dans Drosophila, la spermatogénèse commence par un groupe de cellules souches germinales qui sont situés dans une petite région ou “hub” à un pôle des testis12,13. Ces cellules se divisent par une mitose asymétrique, donnant lieu à un spermatogonium différencié unique. Spermatogonia subit alors quatre mitoses synchrones pour produire un groupe de 16 cellules qui restent étroitement associées dans un seul kyste. À ce stade, les cellules passent d’un cycle mitotique à un cycle de cellules méiotiques et sont appelées spermatocytes. Les spermatocytes passent environ deux à trois jours dans une étape étendue du cycle G2 de la cellule, au cours de laquelle ils se développent de façon spectaculaire et subissent des changements cytologiques en préparation pour les deux divisions méiotiques et la spermiogénèse suivante13,14. Le groupe entier de 16 spermatocytes dans un seul kyste entrent alors dans la première division méiotique en même temps. Ainsi, plusieurs spermatocytes méiotiques peuvent être photographiés simultanément pendant qu’ils procèdent par division cellulaire. La première division méiotique se poursuit pour environ 1,5 h et est suivie presque immédiatement par la deuxième division méiotique, donnant 64 spermiatdés totaux qui continuent à se différencier en spermatozoïde mature.
Un avantage unique de l’utilisation de spermatocytes pour étudier la division cellulaire dans les tissus vivants et intacts est que les groupes ou les kystes des cellules progressent constamment à travers les différents stades de spermatogénèse, et les cellules à tous les stades de la spermatogénèse peuvent généralement être identifiés dans n’importe quel testicule donné (voir la figure 3A). Par conséquent, il est relativement facile de trouver des cellules méiotiques dans des testicules entiers. Nous concentrons généralement nos analyses sur la première par opposition à la méiose seconde parce que ces cellules sont beaucoup plus grandes et plus agréables à l’imagerie à haute résolution, mais l’ensemble du processus englobant les deux divisions méiotiques peut être photographié avec succès. Il convient également de noter que le protocole général pour la préparation et la culture des testicules peut être utilisé pour analyser d’autres processus de spermatogénèse ainsi, tels que les divisions antérieures de cellules souches mitotiques ou spermatogonial ou les changements cytologiques qui se produisent pendant que les spermatotines mûrissent dans spermatozoa15. Beaucoup de ces aspects de la spermatogénèse sont fortement conservés entre Drosophila et les humains16.
Les spermatocytes de Drosophila commencent à atteindre la phase méiotique de spermatogénèse pendant le troisième stade larvaire instar du développement de Drosophila 13. Par conséquent, les testicules isolés des stades du cycle de vie en commençant par les larves de troisième étoile et y compris les pupes et les adultes peuvent être utilisés pour l’analyse de la division des spermatocytes. Plusieurs protocoles excellents sont disponibles pour l’extraction des testicules de mouches mâles adultes pour l’analyse vivante et fixe de la spermatogénèse17,18,19. Ces protocoles peuvent être préférables pour étudier les stades avancés de la spermatogénèse ou si les marqueurs génétiques qui ne sont visibles que chez les adultes doivent être utilisés. Le protocole se concentre plutôt sur la préparation des testicules à partir de larves et de pupes précoces, car les testicules à ces stades ont plusieurs avantages qui sont spécifiquement pertinents pour l’analyse de division cellulaire par haute résolution, microscopie time-lapse. Tout d’abord, les testicules des larves et des pupes sont plus petits que ceux des adultes, et les cellules à l’intérieur de l’organe sont moins encombrées. Pour cette raison, la division des spermatocytes peut souvent être imagené près de la surface extérieure des testicules larvaires, sans avoir à pénétrer à travers de multiples couches de tissu de diffusion de la lumière. Deuxièmement, les testicules adultes se déplacent rythmiquement en raison des contractions des organes accessoires attachés, et ces mouvements rendent la formation image en time-lapse des cellules individuelles difficile. Et troisièmement, les testicules larvaires sont avantageux lorsqu’ils étudient les mutations génétiques qui causent la létalité pupale ou adulte. Nos méthodes sont optimisées pour la culture à long terme des testicules au stade du microscope, permettant l’imagerie de plusieurs cycles de division cellulaire ou la progression des cellules individuelles à travers de multiples stades de spermatogénèse dans la même préparation. Nous décrivons également un protocole pour la fixation et l’immunostaining des testicules entiers. Dans l’ensemble, nos protocoles sont particulièrement utiles pour ceux qui s’intéressent à l’étude de la division cellulaire dans les tissus intacts, et la capacité de combiner l’analyse de spermatocytes avec des outils génétiques très tractables Drosophila en fait une approche particulièrement puissante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit un protocole pour la préparation des testicules larvaires ou précoces de Drosophila, optimisé pour la formation image vivante à long terme de la division de cellules de spermatocyte. Il s’agit d’une méthode puissante pour l’analyse de la division cellulaire dans le contexte physiologique du tissu intact. La puissance de cette méthode est encore élargie lorsqu’elle est combinée avec des outils génétiques Drosophila, tels que des mutations génétiques spécifiques, la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du ministère de la Défense à J.T.S.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
Riferimenti
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