הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

Abstract

ניתוח ניסיוני של תאים חילוק בחיים, רקמות ואיברים שלמים הוא חיוני להבנת איך חלוקת התא משתלב עם פיתוח, רקמות הומאוסטזיס, ותהליכי מחלות. דרוזופילה ספרמטוציטים שעוברים מיוזיס הם אידיאליים עבור ניתוח זה, כי (1) כל drosophila האשכים המכילים spermatocytes קל יחסית להתכונן למיקרוסקופיה, (2) בגודל גדול של הספרציטים הופך אותם מתאימים היטב לדימות ברזולוציה גבוהה, ו (3) הכלים הגנטיים של drosophila יכול להיות משולב כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיש בקלות להכנת האשכים שלמים מדרוזוהילה הזחלים השלישי והגלמים המוקדמים. אנו מתארים כיצד לזהות ספרמטציטים מיוטיות בתוך האשכים המוכנים וכיצד לדמות אותם חיים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. פרוטוקולים עבור קיבוע והכתים האשכים שלם מסופקים גם. השימוש האשכים זחל יש מספר יתרונות על פרוטוקולים זמינים המשתמשים באשכים מבוגרים לניתוח spermatocyte. החשוב ביותר, האשכים זחל הם קטנים פחות צפוף עם תאים מאשר האשכים למבוגרים, וזה מאפשר מאוד הדמיה ברזולוציה גבוהה של spermatocytes. כדי להדגים את היתרונות הללו ואת היישומים של הפרוטוקולים, אנו מציגים את התוצאות המציגות את ההפצה משנה של הרשת האנדופלזמית לגבי מיקרוטובוקלס במהלך חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ בודד שנוצר על-ידי מיקרוסקופיה בזמן הקפיצה. הפרוטוקולים יכולים להיות משולבים עם הביטוי של כל מספר של חלבונים מתויגים fluorescently או סמנים ארגונית, כמו גם מוטציות גנטיות וכלים גנטיים אחרים, מה שהופך גישה זו חזק במיוחד עבור ניתוח של מנגנוני חלוקת התא בהקשר הפיזיולוגי של רקמות ואיברים שלמים.

Introduction

חלוקת התא לומדת לעתים קרובות באמצעות קווי תאים הגדלים בתרבות¹. למרות שרכשנו שפע של תובנה והבנה לא יסולא בפז של מנגנונים בסיסיים ממחקרים אלה², תאים שגדלו בתרבות לא יכולים ללכוד באופן מלא את הפיזיולוגיה של חלוקת התא כפי שהוא מתרחש ברקמה חיה שלמה. לדוגמה, ברקמות ובאיברים שלמים, התאים חייבים להתחלק במקום הנכון ובזמן הנכון כך שתאים צאצאים ממוקמים כראוי בתוך הרקמה, כך שהם יכולים לעבור בידול מתאים או תוכניות פונקציונלי, ולכן התפשטות התא מתואמת כראוי עם צמיחה רקמות או הומאוסטזיס³. עבור תאים שגדלו בתרבות מצד שני, החטיבה התא מוסדר בדרך כלל על ידי גורמי גדילה במדיום התרבות⁴, ולכן אנחנו לא יכולים ללמוד מתאים אלה איך בvivo גורמים סביבתיים כגון אדריכלות רקמות או איתות התפתחותי להשפיע על תהליך החלוקה. חשוב גם לציין כי רבים של קווי התא המשמשים לחקר חלוקת התא, כגון התאים הלה ו U2OS, נגזר גידולים גרורתי⁵. לכן, היבטים רבים של הפיזיולוגיה הבסיסית של תאים אלה סרטניים, כגון מנגנוני הרגולציה מחזור התא ויציבות כרומוזומלית, סביר להניח ששונו לעומת תאים בריאים. הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של חלוקת התא, לפיכך, תלויה ביכולתנו ללמוד את התאים המקוריים שלהם, בסביבות vivo השימור מנגנונים פיזיולוגיים וארכיטקטורת רקמות.

ההתקדמות בהבנת האופן שבו חטיבת התאים פועלת בתוך רקמות ואברים שלמים, מתקשים בvivo או בניתוח vivo לשעבר. ראשית, זה יכול להיות קשה או בלתי אפשרי כדי לגשת מחלוקת תאים לניתוח מיקרוסקופי בתוך איברים גדולים או עבה רקמות. שנית, קשה לעתים קרובות לנבא כאשר תאים בודדים מתחלקים בvivo. שלישית, פיזיולוגיה של רקמות עלולה להתדרדר במהירות במהלך התרבות הvivo לשעבר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות נגישות בקלות לניתוח בשידור חי וקבוע של דרוסופילה מלאנומנוציטים בזמן שהם עוברים מחלקות תאים מיוטיות בתוך האשכים שלמים לחלוטין. תאים אלה הם אידיאליים עבור לחיות, לשעבר ניתוח vivo כי הם נגישים בקלות עם שיטות אופטיות סטנדרטיות כגון קונפוקלית מיקרוסקופ, הם מתחלקים בזמנים צפויים ומיקומים, ואת האשכים שלמים ניתן לשמור בתרבות לשעבר vivo עד כ 24 h. בנוסף, דרוזופילה ספרציטים הם תאים עגולים גדולים (כ -20-30 יקרומטר בקוטר) שאינם משנים צורה כאשר הם מתחלקים, והופכים אותם לאידיאליים ברזולוציה גבוהה, הדמיה של מרכיבי הסלולר כגון מנגנון הצירים והאורגלים הציטוטיים. למרות תאים אלה עוברים מיוזה לעומת mitosis, רבים של התהליכים החיוניים החטיבה התא דומים מאוד בין שני אלה מנגנוני חלוקת התא⁶. יתרונות אלה, בשילוב עם כלים גנטיים בעלי עוצמה דרוזוהילה , עשו דרוזוהילה ספרמטציטים בשימוש נרחב בדגם vivo ex של תהליכים של חטיבת תאים חיוניים, כולל היווצרות צירים ורגולציה, ציטוקינזה, ושיפוץ ארגונית וחלוקה למחיצות^7,8,9,10,11.

הספרציטים הם תאים הנמצאים בשלב המיוטיסטי של זרע. בדרוזופילה, מתחילה הזרע עם קבוצה של תאי גזע של germline הממוקמים באזור קטן או “hub” בעמוד אחד של ה^-12,13. תאים אלה מתחלקים על ידי מיטוזיס אסימטרית, ומעניק הרבה spermatogonium אחד הבדיל. הזרע לאחר מכן לעבור ארבעה mitoses סינכרוני כדי לייצר קבוצה של 16 תאים שנותרו קשורים היטב בתוך ציסטה אחת. בשלב זה, התאים מעבר מmitotic למחזור התא meiotic ומכונים spermatocytes. Spermatocytes לבלות שניים עד שלושה ימים בשלב מורחב G2 של מחזור התא, במהלכו הם גדלים באופן דרמטי ולעבור שינויים ציטולוגיים בהכנה עבור שתי חטיבות meiotic ו spermiogenesis הבאים^13,14. הקבוצה כולה של 16 spermatocytes בתוך ציסטה אחת ולאחר מכן להיכנס החלוקה meiotic הראשון באותו זמן. לפיכך, ניתן לבצע יצירת תמונות של מספר ספרציטים במקביל כשהם ממשיכים דרך מחלקת התאים. החטיבה meiotic הראשון ההכנסות עבור כ 1.5 h והוא עקב כמעט מיד על ידי החטיבה השנייה meiotic, מניב 64 הכולל הכוללת כי להמשיך להבדיל לתוך הזרע בוגרת.

היתרון הייחודי של שימוש בספרציטים כדי ללמוד החטיבה התא בחיים, רקמה שלמה היא כי קבוצות או ציסטות של תאים התקדמות מתמדת דרך בשלבים שונים של הזרע, ותאים בכל שלבי הזרע ניתן בדרך כלל להיות מזוהה בכל בעיות נתון (ראה איור 3A). לכן, קל יחסית למצוא תאים meiotic באשכים שלמים. אנחנו בדרך כלל למקד את הניתוחים שלנו על הראשון לעומת מיוזה השני משום תאים אלה הם הרבה יותר גדול ומקובל יותר הדמיה ברזולוציה גבוהה, אבל התהליך כולו המקיף הן מחלקות מיוזה ניתן לבצע דימות בהצלחה. יצוין גם כי הפרוטוקול הכללי לקראת הכנה ותרבות ניתן להשתמש כדי לנתח תהליכים אחרים של הזרע כמו גם, כגון תא הגזע הקודם mitotic או מחלקות spermatogonial או שינויים ציטולוגיים המתרחשים כמו זכותנו מבוגרים לתוך הזרע¹⁵. רבים מן ההיבטים הללו של הזרע נשמרים במידה רבה בין דרוזוהילה לבני אדם¹⁶.

דרוזוהפילה ספרציטים מתחיל להגיע לשלב המיוסטי של הזרע במהלך הזחל השלישי של דרוזוהילה לפיתוח¹³. לפיכך, האשכים מבודדים משלבי מחזור חיים המתחילים בזחלים שלישיים ובכללם גלמים ומבוגרים יכולים לשמש לניתוח של חלוקת ספרציטים. פרוטוקולים מצוינים מספר זמינים עבור חילוץ של האשכים של גברים בוגרים זבובים לניתוח חי וקבוע של זרע בראשית^17,18,19. פרוטוקולים אלה עשויים להיות עדיפים ללמוד בשלבים מאוחרים של הזרע או אם סמנים גנטיים הגלויים רק אצל מבוגרים יש להשתמש. הפרוטוקול מתמקד בהכנה של בדיקת הרימות והגלמים המוקדמים, משום שלאשכים בשלבים אלה יש מספר יתרונות הרלוונטיים במיוחד לניתוח של חלוקת תאים ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ בזמן הקפיצה. ראשית, האשכים של הזחלים והגלמים קטנים יותר מאלה של מבוגרים, והתאים בתוך האיבר הם פחות צפוף. בגלל זה, חלוקת הספרציטים יכולה לעתים קרובות להיות בתמונה ליד המשטח החיצוני של האשכים זחל, מבלי לחדור דרך שכבות מרובות של רקמת פיזור אור. שנית, האשכים מבוגרים לזוז בקצב בשל התכווצויות של אברי האביזר המצורף, ותנועות אלה להפוך זמן לפקיעה הדמיה של תאים בודדים מאתגרת. ושלישית, האשכים הזחל הם יתרון כאשר לומדים מוטציות גנים הגורמות גולמי או מבוגרים השפעה. השיטות שלנו ממוטבת לתרבות ארוכת טווח של האשכים על הבמה המיקרוסקופ, המאפשר דימות של סיבובים מרובים של חלוקת התא או התקדמות של תאים בודדים באמצעות שלבים מרובים של הזרע באותו הכנה. אנו מתארים גם פרוטוקול עבור קיבוע וכתמים חיסוני של האשכים שלמים. בסך הכל, הפרוטוקולים שלנו שימושיים במיוחד עבור אלה המעוניינים ללמוד חלוקת תאים ברקמה שלמה, ואת היכולת לשלב ניתוח spermatocyte עם מאוד צייתן הכלים הגנטיים הופך את זה גישה חזקה במיוחד.

Protocol

1. הכנת בעלי חיים, כלים ומדיה לחיתוך להצליב זבובים זכר ונקבה כדי להשיג צאצאים של גנוטיפ הרצוי. סמנים הטרנסגניים שימושיים לזיהוי ואחסון זמני של הספרציטים כוללים GFP-טובולין כדי לתייג את ציר meiotic ו RFP-histone 2A כדי תווית כרומזומים8. השתמש חמש עד עשר נקבות לחצות ולשמור על צלבים על מ…

Representative Results

כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, האשכים יישארו שלמים לחלוטין לדימות על ידי מיקרוסקופ מוקד או שיטות אחרות מיקרוסקופ הזריחה. כפי שניתן לראות באיור 3a, הארגון הסלולר של האשכים נשמר, ואת ההתקדמות של בידול התא מקצה אחד של הפנים אל השני כולל הזרע, spermatציטים, ו פלואידי spermatids הוא גלוי. …

Discussion

תיארנו פרוטוקול להכנת זחל או גולמי מוקדם drosophila ילה האשכים, אופטימיזציה לטווח ארוך, לחיות הדמיה של מחלקת התא spermatocyte. זוהי שיטה רבת-עוצמה לניתוח חלוקת תאים בהקשר הפיזיולוגי של רקמות שלמות. העוצמה של שיטה זו מורחבת עוד יותר כאשר בשילוב עם כלים גנטיים דרוזוהילה , כגון מוטציות גנטיות ?…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium