Murine Precision-Cut Liver Slices comme un modèle Ex Vivo de biologie du foie
Summary
Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour la production de tranches de foie de précision viables de souris. Les échantillons de tissu ex vivo peuvent être maintenus dans des conditions de culture tissulaire de laboratoire pendant plusieurs jours, fournissant un modèle flexible pour examiner la pathobiologie de foie.
Abstract
Comprendre les mécanismes des lésions hépatiques, de la fibrose hépatique et de la cirrhose qui sous-tendent les maladies chroniques du foie (c.-à-d. l’hépatite virale, l’affection hépatique non alcoolique, l’affection hépatique métabolique et le cancer du foie) nécessite une manipulation expérimentale de modèles animaux et les cultures cellulaires in vitro. Les deux techniques ont des limites, telles que l’exigence d’un grand nombre d’animaux pour la manipulation in vivo. Cependant, les cultures cellulaires in vitro ne reproduisent pas la structure et la fonction de l’environnement hépatique multicellulaire. L’utilisation de tranches de foie coupées avec précision est une technique dans laquelle des tranches uniformes de foie de souris viable sont maintenues dans la culture tissulaire de laboratoire pour la manipulation expérimentale. Cette technique occupe une niche expérimentale qui existe entre les études animales et les méthodes de culture cellulaire in vitro. Le protocole présenté décrit une méthode simple et fiable pour isoler et culture des tranches de foie de précision-coupé de souris. Comme application de cette technique, les tranches de foie ex vivo sont traitées avec des acides biliaires pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques et finalement évaluer les mécanismes de la fibrogenèse hépatique.
Introduction
La pathogénie de la plupart des maladies chroniques du foie (c.-à-d. l’hépatite virale, la stéatohépatite non alcoolique, les lésions hépatiques cholestatiques et le cancer du foie) implique des interactions complexes entre plusieurs types de cellules hépatiques différentes qui conduisent l’inflammation, la fibrogenèse, et le développement du cancer1,2. Pour comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces maladies chroniques à base de foie, les interactions entre les multiples types de cellules hépatiques doivent être étudiées. Bien que les lignées cellulaires hépatiques multiples (et plus récemment, les organoïdes) peuvent être cultivées in vitro, ces modèles n’imitent pas exactement la structure complexe, la fonction et la diversité cellulaire du microenvironnement hépatique3. En outre, les cellules hépatiques cultivées (en particulier, les lignées cellulaires transformées) peuvent s’écarter de leur biologie source originale. Les modèles animaux sont utilisés expérimentalement pour étudier les interactions entre les multiples types de cellules hépatiques. Cependant, ils peuvent devenir considérablement réduits dans la portée pour la manipulation expérimentale, en raison d’effets hors cible significatifs dans les organes extrahépatiques (par exemple, lors de l’essai thérapeutiques potentielles).
L’utilisation de tranches de foie découpées de précision (PCLS) dans la culture tissulaire est une technique expérimentale utilisée pour la première fois dans les études sur le métabolisme des médicaments et la toxicité, et elle implique la coupe de tranches de foie viables, ultrathines (environ 100 à 250 m d’épaisseur). Cela permet la manipulation expérimentale directe du tissu hépatique ex vivo4. La technique comble un fossé expérimental entre les études animales in vivo et les méthodes de culture cellulaire in vitro, surmontant de nombreux inconvénients des deux méthodes (c.-à-d. des limites pratiques sur la gamme d’expériences qui peuvent être effectuées chez des animaux entiers ainsi que la perte de structure/fonction et de diversité cellulaire avec des méthodes de culture cellulaire in vitro).
En outre, pcLS augmente considérablement la capacité expérimentale par rapport aux études animales entières. Comme une souris peut produire plus de 48 tranches de foie, cela facilite également l’utilisation de groupes de contrôle et de traitement à partir du même foie. En outre, la technique sépare physiquement le tissu hépatique des autres systèmes d’organes ; par conséquent, il élimine les effets potentiels hors cible qui peuvent se produire chez les animaux entiers lors de l’essai des effets des stimuli exogènes.
Dans ce protocole, les PCLS sont générés à l’aide d’un vibratome avec une lame qui vibre latéralement. D’autres études ont utilisé avec succès un trancheur de tissu Krumdieck, tel que décrit dans Olinga et Schuppan5. Dans le vibratome, la vibration latérale de la lame empêche la déchirure du tissu ultrathin causé par le stress de cisaillement, comme la lame est poussée dans le tissu. Le vibratome et le trancheur de tissu de Krumdieck fonctionnent efficacement sans l’intégration structurelle du tissu de foie, qui simplifie la procédure de tranchement. Cette technique peut également être utilisée pour créer des PCLS à partir de foies malades, y compris ceux des modèles murins de la fibrose/cirrhose6 et la stéatose hépatique7.
En plus de démontrer les techniques requises pour la préparation et la culture tissulaire de PCLS, ce rapport examine également la viabilité de ces tissus ex vivo en mesurant les niveaux de triphosphate d’adénosine (ATP) et en examinant l’histologie de tissu pour évaluer la nécrose et la fibrose. En tant que procédure expérimentale représentative, les PCLS sont traités avec des concentrations pathophysiologiques de trois acides biliaires différents (acides glycocholiques, taurochiques et choliques) pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques. Dans le contexte des lésions hépatiques cholestatiques, l’acide taurocholic en particulier s’est avéré être sensiblement augmenté dans le sérum et la bile des enfants atteints de fibrose kystique-associée à la maladie du foie8.
Les cellules progénitrices de foie ont également été traitées in vitro avec l’acide taurocholic pour simuler les niveaux élevés d’acide taurocholic observés dans les patients, et ce traitement a causé la prolifération accrue et la différenciation des cellules progénitrices de foie vers un phénotype biliaire (cholangiocyte)9. Par la suite, les PCLS ont été traités ex vivo avec des niveaux élevés d’acide taurocholic, et des marqueurs cholangiocytes accrus ont été observés. Ceci soutient l’observation in vitro que l’acide taurocholic conduit la prolifération biliaire et/ou la différenciation dans le contexte de la maladie hépatique kystique-associée pédiatrique9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole démontre l’application de l’isolement murine de PCLS et de la culture de tissu, et les procédures sont conçues pour évaluer la viabilité et l’utilité aussi bien que pour examiner des impacts des médiateurs exogènes de pathobiologie de foie utilisant des essais biochimiques, l’histologie, et qPCR. L’utilité expérimentale de la culture tissulaire PCLS chez les rongeurs et les humains a été démontrée dans un large éventail d’applications, y compris des investigations expérimentales d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de recherche du National Health and Medical Research Council (NHMRC) d’Australie (Grant No. APP1048740 et APP1142394 à G.A.R.; APP1160323 à J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm est soutenu par une bourse de recherche senior du NHMRC d’Australie (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo a été soutenu par le programme TALENTO de Madrid, Espagne (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
Riferimenti
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
