Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie
Summary
Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Herstellung von lebensfähigen präzisionsgeschnittenen Leberscheiben von Mäusen. Die Ex-vivo-Gewebeproben können mehrere Tage lang unter Labor-Gewebekulturbedingungen aufbewahrt werden, was ein flexibles Modell zur Untersuchung der Leberpathobiologie bietet.
Abstract
Das Verständnis der Mechanismen von Leberschäden, Leberfibrose und Zirrhose, die chronischen Lebererkrankungen zugrunde liegen (d. h. virale Hepatitis, nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen und Leberkrebs) erfordert eine experimentelle Manipulation von Tiermodelle und In-vitro-Zellkulturen. Beide Techniken haben Einschränkungen, wie z. B. die Anforderung einer großen Anzahl von Tieren für in vivo-Manipulation. In-vitro-Zellkulturen reproduzieren jedoch nicht die Struktur und Funktion der multizellulären Leberumgebung. Die Verwendung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben ist eine Technik, bei der einheitliche Scheiben lebensfähiger Mausleber in der Laborgewebekultur für experimentelle Manipulationen gepflegt werden. Diese Technik nimmt eine experimentelle Nische ein, die zwischen Tierstudien und In-vitro-Zellkulturmethoden besteht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode, um präzisionsgeschnittene Leberscheiben von Mäusen zu isolieren und zu kultiieren. Als Anwendung dieser Technik werden ex vivo Leberscheiben mit Gallensäuren behandelt, um cholestatische Leberverletzungen zu simulieren und schließlich die Mechanismen der Leberfibrogenese zu bewerten.
Introduction
Die Pathogenese der meisten chronischen Lebererkrankungen (d.h. Viralhepatitis, nichtalkoholische Steatohepatitis, cholestatische Leberverletzung und Leberkrebs) beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen mehreren verschiedenen Leberzelltypen, die Entzündungen, Fibrogenese und Krebsentwicklung antreiben1,2. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesen chronischen Lebererkrankungen zugrunde liegen, müssen die Wechselwirkungen zwischen mehreren Leberzelltypen untersucht werden. Während mehrere Leberzelllinien (und in jüngerer Zeit, Organoide) in vitro kultiviert werden können, emulieren diese Modelle nicht genau die komplexe Struktur, Funktion und zelluläre Vielfalt der leberförmigen Mikroumgebung3. Darüber hinaus können kultivierte Leberzellen (insbesondere transformierte Zelllinien) von ihrer ursprünglichen Quellbiologie abweichen. Tiermodelle werden experimentell verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen mehreren Leberzelltypen zu untersuchen. Sie können jedoch aufgrund signifikanter Off-Target-Effekte in extrahepatischen Organen (z. B. bei der Erprobung potenzieller Therapeutika) in der Ergreifung simontierungsmittel signifikant reduziert werden.
Die Verwendung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben (PCLS) in der Gewebekultur ist eine experimentelle Technik, die zuerst in Arzneimittelstoffwechsel- und Toxizitätsstudien verwendet wird, und es beinhaltet das Schneiden lebensfähiger, ultradünner Leberscheiben (ca. 100 x 250 m dick). Dies ermöglicht die direkte experimentelle Manipulation von Lebergewebe ex vivo4. Die Technik überbrückt eine experimentelle Lücke zwischen in vivo Tierstudien und In-vitro-Zellkulturmethoden und überwindet viele Nachteile beider Methoden (d. h. praktische Grenzen des Versuchsspektrums, die bei ganzen Tieren durchgeführt werden können, sowie Verlust von Struktur/Funktion und zellulärer Vielfalt mit In-vitro-Zellkulturmethoden).
Darüber hinaus erhöht PCLS die Experimentelle Kapazität im Vergleich zu ganzen Tierstudien erheblich. Da eine Maus mehr als 48 Leberscheiben produzieren kann, erleichtert dies auch die Verwendung von Kontroll- und Behandlungsgruppen aus der gleichen Leber. Darüber hinaus trennt die Technik physisch das Lebergewebe von anderen Organsystemen; Daher entfernt es potenzielle Off-Target-Effekte, die bei ganzen Tieren auftreten können, wenn die Auswirkungen exogener Reize getestet werden.
In diesem Protokoll werden PCLS mit einem Vibratom mit einer seitlich vibrierenden Klinge erzeugt. Andere Studien haben erfolgreich einen Krumdieck-Gewebeschneider verwendet, wie in Olinga und Schuppan5beschrieben. Im Vibratom verhindert die seitliche Vibration der Klinge das Reißen des ultradünnen Gewebes, das durch Scherspannung verursacht wird, da die Klinge in das Gewebe geschoben wird. Sowohl der Vibratome als auch der Krumdieck-Gewebeschneider arbeiten effektiv ohne strukturelle Einbettung von Lebergewebe, was das Schneidverfahren rationalisiert. Diese Technik kann auch verwendet werden, um PCLS aus erkrankten Lebern zu erstellen, einschließlich derer von Mausmodellen der Fibrose/Zirrhose6 und der Hepatischen Steatose7.
Neben dem Nachweis der für die Präparation und Gewebekultur von PCLS erforderlichen Techniken untersucht dieser Bericht auch die Lebensfähigkeit dieser Ex-vivo-Gewebe, indem adenosintriphosphat (ATP)-Spiegel gemessen und die Gewebehistologie zur Beurteilung von Nekrose und Fibrose untersucht wird. Als repräsentatives experimentelles Verfahren werden PCLS mit pathophysiologischen Konzentrationen von drei verschiedenen Gallensäuren (Glyochkol-, Taurocholi- und Cholsäuren) behandelt, um cholestatische Leberverletzungen zu simulieren. Im Zusammenhang mit cholestatischen Leberverletzungen hat sich insbesondere bei Kindern mit mukovisenfibroseassoziierter Lebererkrankung8gezeigt, dass Taurocholsäure sowohl im Serum als auch bei der Galle signifikant erhöht ist.
Lebervorläuferzellen wurden auch in vitro mit Taurocholsäure behandelt, um die erhöhten Taurocholsäurespiegel bei Patienten zu simulieren, und diese Behandlung verursachte erhöhte Proliferation und Differenzierung von Lebervorläuferzellen in Richtung eines gallenhaltigen (Cholangiozyten) Phänotyps9. In der Folge wurden PCLS ex vivo mit erhöhten Stufen von Taurocholsäure behandelt, und erhöhte Cholangiozytenmarker wurden beobachtet. Dies unterstützt die In-vitro-Beobachtung, dass Taurocholsäure die Gallenproliferation und/oder Differenzierung im Zusammenhang mit der pädiatrischen Mukoviszidose-assoziierten Lebererkrankung9antreibt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll demonstriert die Anwendung der murinen PCLS-Isolierung und Gewebekultur, und die Verfahren sind entworfen, um sowohl die Lebensfähigkeit und nützlich zu bewerten sowie die Auswirkungen von exogenen Mediatoren der Leberpathobiologie mit biochemischen Assays, Histologie und qPCR zu untersuchen. Der experimentelle Nutzen der PCLS-Gewebekultur bei Nagetieren und Menschen wurde in einer Vielzahl von Anwendungen nachgewiesen, einschließlich experimenteller Untersuchungen in microRNA15/R…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia (Grant No. APP1048740 und APP1142394 zu G.A.R.; APP1160323 bis J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm wird von einem Senior Research Fellowship des NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo wurde vom TALENTO-Programm von Madrid, Spanien (T1-BIO-1854) unterstützt.
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
Riferimenti
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
