Omvendt transkripsjon Loop-Mediert Isothermal Amplification (RT-LAMP) Analyse for spesifikk og rask deteksjon av Tilapia Lake Virus
Summary
Vi presenterer en RT-LAMP analyse for påvisning av TiLV i tilapia fisk ved hjelp av enkle instrumenter over en relativt kort periode sammenlignet med konvensjonelle RT-PCR teknikker. Denne protokollen kan bidra til å kontrollere epidemispredningen av TiLVD, spesielt i utviklingsland.
Abstract
Tilapia lake virus sykdom (TiLVD), en fremvoksende virussykdom i tilapia forårsaket av tilapia innsjø virus (TiLV), er en vedvarende utfordring i akvakulturindustrien som har resultert i masse sykelighet og dødelighet av tilapia i mange deler av verden. En effektiv, rask og nøyaktig diagnostisk analyse for TiLV-infeksjon er derfor nødvendig for å oppdage den første infeksjonen og for å forhindre spredning av sykdommen i akvakulturoppdrett. I denne studien presenteres en svært følsom og praktisk omvendt transkripsjonloop-mediert isothermal forsterkning (RT-LAMP) metode for å oppdage tilapia innsjøvirus i fiskevev. En sammenligning av RT-qPCR- og RT-LAMP-analyser av infiserte prøver viste positive resultater i 63 (100%) og 51 (80,95 %) prøver, henholdsvis. Videre viste en analyse av uinfiserte prøver at alle 63 uinfiserte vev ga negative resultater for både RT-qPCR og RT-LAMP-analyser. Kryssreaktiviteten med fem patogener i tilapia ble evaluert ved hjelp av RT-LAMP, og alle testene viste negative resultater. Både lever- og slimprøvene hentet fra infisert fisk viste sammenlignbare resultater ved hjelp av RT-LAMP-metoden, noe som tyder på at slim kan brukes i RT-LAMP som en nonlethal analyse for å unngå å drepe fisk. Til slutt viste resultatene at den presenterte RT-LAMP-analysen gir en effektiv metode for TiLV-deteksjon i tilapiavev innen 1 h. Metoden anbefales derfor som et screeningverktøy på gårder for rask diagnose av TiLV.
Introduction
Tilapia lake virus sykdom (TiLVD) er en virussykdom i tilapia (Oreochromis spp.) som angivelig forårsaker tilapia dødsfall i mange regioner av verden, inkludert Asia1,2, Afrika og Amerika. Sykdommen ble først anerkjent under massedødeligheten av tilapia i 2009 i Israel, hvor antall vill tilapia i Kinneretsjøen falt dramatisk fra 257 til 8 tonn per år2. Sykdommen er forårsaket av tilapia innsjø virus (TiLV), som har blitt tildelt familien Amnoonviridae som en ny slekt Tilapinevirus og en ny art Tilapia tilapinevirus3. Genetisk karakterisering av TiLV viste at viruset er en roman innhyllet, negativ-sense, enkelt-strandet RNA virus som har 10 segmenter koding 10 proteiner1,2,4. Ulike arter av tilapia i slekten Sarotherodon, Oreochromis, og Tilapine og andre varme vannfisk (f.eks gigantiske gourami (Osphronemus goramy)) har vist seg å være utsatt for TiLV2,5. Foreløpig fortsetter dette viruset å spre seg globalt, muligens gjennom bevegelse av infisert levende fisk6,7, mens risikoen for viral overføring via frossen tilapia eller produktet er begrenset8. Betydelig dødelighet på grunn av TiLV-infeksjon har potensial til å ha en betydelig skadelig økonomisk innvirkning på tilapiaindustrien. For eksempel ble den økonomiske effekten av sommerdødelighetssyndrom i Egypt forbundet med TiLV-infeksjon beregnet til US $ 100 millioner9. Følgelig er det viktig å utvikle en rask og riktig diagnostisk metode for å lette kontrollen av denne sykdommen i oppdrettsanlegg.
Inntil nå har diagnosen TiLVD vært basert på molekylære analyser, viral isolasjon og histopatologi. Ulike PCR-protokoller og primere er utviklet for TiLV diagnose10,11. For eksempel, en SYBR grønn-basert omvendt transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) metode med følsomhet for å oppdage så få som to kopier / μL av viruset er utviklet og validert for TiLV deteksjon10. Andre PCR-metoder for TiLV-deteksjon inkluderer TaqMan kvantitativ PCR11,RT-PCR2,nestet RT-PCR12og halvnestet RT-PCR13. Disse metodene krever imidlertid sofistikert laboratorieutstyr og relativt lengre perioder for å gi resultater på grunn av kompleksiteten i reaksjonene, noe som gjør dem uegnet for feltapplikasjon.
Den loop-medierte isothermal forsterkning (LAMP) analysen er en rask, enkel og praktisk for-feltet søknad14,15. Teknikken benytter prinsippet om en trådforskyvningsreaksjon, mens forsterkningsreaksjonen går under isothermale forhold uten en sofistikert og dyr termisk cycler14,15. Følgelig analyseres forsterkede LAMP-produkter eller RT-LAMP-produkter i stigelignende bånd ved hjelp av agarose gelelektroforese med en fluorescerende flekk for enten sikker visualisering av DNA eller RNA14 eller observasjon med det blotte øye for tilstedeværelse av turbiditet eller en hvit utfelling16,17,18. Av disse grunnene har denne teknikken blitt brukt til påvisning av ulike fiskepatogener17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Hensikten med denne studien var å etablere en rask, følsom og nøyaktig RT-LAMP-analyse for TiLV-deteksjon. RT-LAMP-analysen tilbyr screening for TiLV i fiskeprøver innen 30 min. Teknikken kan brukes for diagnose og overvåking av TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Havbruksnæringen er stadig truet av virusinfeksjoner som forårsaker betydelige økonomiske tap9,23,28. For eksempel utgjør den nye TiLV en stor trussel mot tilapia-produserende land i mange deler av verden1,6,9. Inntil nå har det ikke vært noen spesifikke terapeutiske midler tilgjengelig for å forhindre TiLVD. Mens utviklingen av …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjektet er finansiert av Thailand Research Fund (TRF) stipendnummer RDG6050078 og Senter for avanserte studier for landbruk og mat, Institutt for avanserte studier, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under Higher Education Research Promotion og National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. Forskningen støttes delvis av Graduate Program Scholarship fra Graduate School, Kasetsart University. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for fortellingen som snakker om videoen og Piyawatchara Sikarin for redigering av videoen.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
Riferimenti
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Biologia dello sviluppo. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
