Analisi dell'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP) Per il rilevamento specifico e rapido del virus del lago Tilapia
Summary
Vi presentiamo un saggio RT-LAMP per la rilevazione di TiLV nel pesce tilapia utilizzando strumenti semplici per un periodo di tempo relativamente breve rispetto alle tecniche RT-PCR convenzionali. Questo protocollo può aiutare a controllare la diffusione epidemica di TiLVD, soprattutto nei paesi in via di sviluppo.
Abstract
La malattia virale del lago Tilapia (TiLVD), una malattia virale emergente nella tilapia causata dal virus del lago tilapia (TiLV), è una sfida persistente nell’industria dell’acquacoltura che ha portato alla morbilità di massa e alla mortalità della tilapia in molte parti del mondo. Un test diagnostico efficace, rapido e accurato per l’infezione da TiLV è quindi necessario per rilevare l’infezione iniziale e prevenire la diffusione della malattia nell’agricoltura dell’acquacoltura. In questo studio, viene presentato un metodo di amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP) altamente sensibile e pratico e pratico nel tessuto ittico. Un confronto dei saggi RT-qPCR e RT-LAMP di campioni infetti ha rivelato risultati positivi in 63 (100%) e 51 (80,95%) campioni, rispettivamente. Inoltre, un’analisi di campioni non infetti ha mostrato che tutti i 63 tessuti non infetti hanno prodotto risultati negativi sia per i saggi RT-qPCR che RT-LAMP. La reattività incrociata con cinque agenti patogeni in tilapia è stata valutata utilizzando RT-LAMP, e tutti i test hanno mostrato risultati negativi. Sia i campioni di fegato che di muco ottenuti da pesci infetti hanno mostrato risultati comparabili utilizzando il metodo RT-LAMP, suggerendo che il muco può essere utilizzato in RT-LAMP come un saggio non letale per evitare di uccidere i pesci. In conclusione, i risultati hanno dimostrato che il test RT-LAMP presentato fornisce un metodo efficace per il rilevamento TiLV nel tessuto tilapia entro 1 h. Il metodo è quindi raccomandato come strumento di screening nelle aziende agricole per la diagnosi rapida di TiLV.
Introduction
La malattia da virus del lago Tilapia (TiLVD) è una malattia virale in tilapia (Oreochromis spp.) che, secondo quanto riferito, causa la morte di tilapia in molte regioni del mondo, tra cui Asia1,2, Africa e America. La malattia è stata riconosciuta per la prima volta durante la mortalità di massa di tilapia nel 2009 in Israele, dove il numero di tilapia selvatici nel lago Kinneret è crollato drammaticamente da 257 a 8 tonnellate all’anno2. La malattia è causata dal virus del lago tilapia (TiLV), che è stato assegnato alla famiglia Amnoonviridae come un nuovo genere Tilapinevirus e una nuova specie Tilapia tilapinevirus3. La caratterizzazione genetica di TiLV ha mostrato che il virus è un nuovo virus a singolo filo avvolto, dal senso negativo, che ha 10 segmenti che codificano 10 proteine1,2,4.4 Varie specie di tilapia del genere Sarotherodon, Oreochromis, tilapina e altri pesci d’acqua calda (ad esempio, gourami gigante (Osphronemus goramy)) hanno dimostrato di essere suscettibili a TiLV2,5. Attualmente, questo virus continua a diffondersi a livello globale, possibilmente attraverso il movimento di pesci vivi infetti6,7, mentre il rischio di trasmissione virale tilapia congelati o il suo prodotto è limitato8. Mortalità sostanziale dovuta all’infezione da TiLV ha il potenziale per avere un impatto economico significativamente dannoso sull’industria della tilapia. Ad esempio, l’impatto economico della sindrome della mortalità estiva in Egitto associata all’infezione da TiLV è stato calcolato per essere di 100 milioni di dollari9. Di conseguenza, è importante sviluppare un metodo diagnostico rapido e adeguato per facilitare il controllo di questa malattia negli allevamenti ittici.
Fino ad ora, la diagnosi di TiLVD si è basata su saggi molecolari, isolamento virale e istopatologia. Diversi protocolli PCR e primer sono stati sviluppati per la diagnosi TiLV10,11. Ad esempio, è stato sviluppato e convalidato un metodo PCR quantitativo (RT-qPCR) di trascrizione inversa basato sul verde SYBR con la sensibilità di rilevare solo due copie/L del virus che è stato sviluppato e convalidato per il rilevamento TiLV10. Altri metodi PCR per il rilevamento TiLV includono TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, RT-PCR12annidato e RT-PCR semi-nidificato13. Tuttavia, questi metodi richiedono sofisticate attrezzature di laboratorio e periodi di tempo relativamente lunghi per produrre risultati a causa della complessità delle reazioni, il che le rende inadatte per l’applicazione sul campo.
L’analisi dell’amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) è un’applicazione rapida, semplice e pratica per il campo14,15. La tecnica utilizza il principio di una reazione di spostamento del filo, mentre la reazione di amplificazione viene eseguita in condizioni isotermiche senza un sofisticato e costoso ciclore termico14,15. Di conseguenza, i prodotti LAMP amplificati o i prodotti RT-LAMP vengono analizzati in fasce simili a scaletta utilizzando l’elettroforesi gel agarose con una macchia fluorescente per la visualizzazione sicura del DNA o dell’RNA14 o l’osservazione ad occhio nudo per la presenza di torbidità o un precipitato bianco16,17,18. Per questi motivi, questa tecnica è stata utilizzata per il rilevamento in loco di diversi patogeni ittici17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un rapido, sensibile e accurato teste RT-LAMP per il rilevamento TiLV. Il test RT-LAMP offre screening per TiLV in campioni di pesce entro 30 min. La tecnica può essere applicata per la diagnosi e la sorveglianza di TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’industria dell’acquacoltura è continuamente minacciata da infezioni virali che causano notevoli perdite economiche9,23,28. Ad esempio, l’emergente TiLV rappresenta una grave minaccia per i paesi produttori di tilapia in molte parti del mondo1,6,9. Fino ad ora, non ci sono state terapie specifiche disponibili per prevenire TiLVD. Ment…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è finanziato finanziariamente dal thailandese Research Fund (TRF) numero di sovvenzione RDG6050078 e il Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailandia sotto il Higher Education Research Promotion e National Research University Project of Thailand, Ufficio della Commissione per l’istruzione superiore, Ministero dell’Istruzione, Thailandia. La ricerca è sostenuta in parte dalla Graduate Program Scholarship della Graduate School, Kasetsart University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kwanrawee Sirikanchana per la narrazione del video e Piyawatchara Sikarin per aver modificato il video.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
Riferimenti
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