Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus
Summary
Nous présentons un essai RT-LAMP pour la détection de TiLV chez le poisson tilapia à l’aide d’instruments simples sur une période de temps relativement courte par rapport aux techniques RT-PCR conventionnelles. Ce protocole peut aider à contrôler la propagation épidémique de TiLVD, en particulier dans les pays en développement.
Abstract
La maladie du virus du lac de Tilapia (TiLVD), une maladie virale émergente du tilapia causée par le virus du lac tilapia (TiLV), est un défi persistant dans l’industrie aquacole qui a entraîné la morbidité et la mortalité massives du tilapia dans de nombreuses régions du monde. Un essai diagnostique efficace, rapide et précis pour l’infection de TiLV est donc nécessaire pour détecter l’infection initiale et pour empêcher la propagation de la maladie dans l’agriculture aquacole. Dans cette étude, une méthode très sensible et pratique d’amplification isothermale (RT-LAMP) de transcription inverse très sensible et pratique est présentée pour détecter le virus du lac de tilapia dans les tissus du poisson. Une comparaison des essais RT-qPCR et RT-LAMP d’échantillons infectés a révélé des résultats positifs dans 63 (100%) et 51 (80,95%) échantillons, respectivement. En outre, une analyse des échantillons non infectés a montré que les 63 tissus non infectés ont donné des résultats négatifs pour les essais RT-qPCR et RT-LAMP. La réactivité croisée avec cinq agents pathogènes dans le tilapia a été évaluée à l’aide de RT-LAMP, et tous les tests ont montré des résultats négatifs. Les échantillons de foie et de mucus obtenus à partir de poissons infectés ont montré des résultats comparables en utilisant la méthode RT-LAMP, suggérant que le mucus peut être utilisé dans RT-LAMP comme un essai non létal pour éviter de tuer des poissons. En conclusion, les résultats ont démontré que l’essai RT-LAMP présenté fournit une méthode efficace pour la détection de TiLV dans le tissu de tilapia dans un rayon de 1 h. La méthode est donc recommandée comme outil de dépistage sur les fermes pour le diagnostic rapide de TiLV.
Introduction
La maladie par le virus du lac de Tilapia (TiLVD) est une maladie virale dans le tilapia(Oreochromis spp.) qui causerait des décès de tilapia dans de nombreuses régions du monde, y compris l’Asie1,2, l’Afrique et l’Amérique. La maladie a été identifiée pour la première fois lors de la mortalité massive du tilapia en 2009 en Israel, où le nombre de tilapia sauvage dans le lac Kinneret a chuté de façon spectaculaire, passant de 257 à 8 tonnes par an2. La maladie est causée par le virus du lac de tilapia (TiLV), qui a été attribué à la famille Amnoonviridae comme un nouveau genre Tilapinevirus et une nouvelle espèce Tilapia tilapinevirus3. La caractérisation génétique de TiLV a montré que le virus est un nouveau, négatif-sens, virus de l’ARN à brin unique qui a 10 segments codant 10 protéines1,2,4. Diverses espèces de tilapia dans le genre Sarotherodon, Oreochromis, et Tilapine et d’autres poissons d’eau chaude (par exemple, gourami géant (Osphronemus goramy))ont été montrés pour être sensibles à TiLV2,5. Actuellement, ce virus continue de se propager à l’échelle mondiale, peut-être par le mouvement de poissons vivants infectés6,7, tandis que le risque de transmission virale via le tilapia congelé ou son produit est limité8. La mortalité importante due à l’infection tiLV a le potentiel d’avoir un impact économique considérablement préjudiciable sur l’industrie du tilapia. Par exemple, l’impact économique du syndrome de mortalité estivale en Égypte associé à l’infection par tiLV a été estimé à 100 millions de dollarsEU 9. Par conséquent, il est important de mettre au point une méthode diagnostique rapide et appropriée pour faciliter le contrôle de cette maladie dans les exploitations piscicoles.
Jusqu’à présent, le diagnostic de TiLVD a été basé sur les essais moléculaires, l’isolement viral, et l’histopathologie. Différents protocoles PCR et amorces ont été développés pour le diagnostic TiLV10,11. Par exemple, une méthode quantitative PCR (RT-QPCR) basée sur le vert SYBR avec la sensibilité de détecter aussi peu que deux copies/L du virus a été développée et validée pour la détection TiLV10. D’autres méthodes PCR pour la détection TiLV comprennent TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, imbriqué RT-PCR12, et semi-niché RT-PCR13. Cependant, ces méthodes nécessitent un équipement de laboratoire sophistiqué et des périodes de temps relativement prolongées pour donner des résultats en raison de la complexité des réactions, ce qui les rend impropres à l’application sur le terrain.
L’essai d’amplification isothermale à médiation en boucle (LAMP) est une application rapide, simple et pratique pour le champ14,15. La technique utilise le principe d’une réaction de déplacement de brin, tandis que la réaction d’amplification fonctionne dans des conditions isothermales sans un cycleur thermique sophistiqué et coûteux14,15. Par conséquent, les produits LAMP amplifiés ou les produits RT-LAMP sont analysés dans des bandes en valeur d’échelle à l’aide d’électrophoresis gel agarose avec une tache fluorescente pour la visualisation sûre de l’ADN ou de l’ARN14 ou l’observation à l’œil nu pour la présence de turbidité ou d’un précipité blanc16,17,18. Pour ces raisons, cette technique a été utilisée pour la détection sur place de différents pathogènes du poisson17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Le but de cette étude était d’établir un essai rapide, sensible et précis de RT-LAMP pour la détection de TiLV. L’essai RT-LAMP offre un dépistage du TiLV dans des échantillons de poissons dans un délai de 30 min. La technique peut être appliquée pour le diagnostic et la surveillance de TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’industrie aquacole est continuellement menacée par des infections virales qui causent des pertes économiques importantes9,23,28. Par exemple, le TiLV émergent représente une menace majeure pour les pays producteurs de tilapia dans de nombreuses parties du monde1,6,9. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de thérapeutique spé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet est financé financièrement par le numéro de subvention du Fonds de recherche thaïlandais (TRF) RDG6050078 et le Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under the Higher Education Research Promotion et National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. La recherche est appuyée en partie par la bourse d’études supérieures de l’École supérieure de l’Université Kasetsart. Les auteurs tiens à remercier le Dr Kwanrawee Sirikanchana pour le récit parlant de la vidéo et Piyawatchara Sikarin pour l’édition de la vidéo.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
Riferimenti
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