Toepassing van Atomic Force Microscopie om vroege artrose op te sporen
Summary
We presenteren een methode om vroege artroseveranderingen op cellulair niveau in gewrichtskraakbeen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM).
Abstract
Biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels regelen niet alleen hun vorm en functie, maar zijn ook cruciaal voor het behoud van hun vitaliteit. Veranderingen in elasticiteit kunnen zich voortplanten of het begin van belangrijke ziekten zoals kanker of artrose (OA) veroorzaken. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een sterk instrument om de biomechanische eigenschappen van specifieke biologische doelstructuren op microscopische schaal kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren, meetkrachten in een bereik van zo klein als de piconewton tot de micronewton. Biomechanische eigenschappen zijn van bijzonder belang in spier- en skeletweefsels, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van spanning. OA als een degeneratieve ziekte van het kraakbeen resulteert in de verstoring van de pericellulaire matrix (PCM) en de ruimtelijke herschikking van de chondrocyten ingebed in hun extracellulaire matrix (ECM). Verstoring in PCM en ECM is geassocieerd met veranderingen in de biomechanische eigenschappen van kraakbeen. In deze studie gebruikten we de AFM om deze veranderingen te kwantificeren in relatie tot de specifieke ruimtelijke patroonveranderingen van de chondrocyten. Bij elke patroonwijziging werden significante veranderingen in elasticiteit waargenomen voor zowel het PCM als de ECM. Het meten van de lokale elasticiteit maakt het dus mogelijk om directe conclusies te trekken over de mate van lokale weefseldegeneratie in OA.
Introduction
Gewrichtskraakbeen is een avasculair, aneural weefsel. Dunverspreide chondrocyten produceren, organiseren en onderhouden een expansieve extracellulaire matrix (ECM) waarin ze zijn ingebed. Als een duidelijk en gespecialiseerd onderdeel van de ECM, zijn chondrocyten omgeven door een dunne laag van gespecialiseerde matrix bekend als de pericellulaire matrix (PCM). De PCM fungeert als een mechanogevoelige cel-matrix interface1 die de chondrocyten2 beschermt en hun biosynthetische responsmoduleert 3. Zoals eerder beschreven4, in gezond kraakbeen, zijn de chondrocyten gerangschikt in specifieke, verschillende ruimtelijke patronen die specifiek zijn voor elke weefsellaag en gewricht4,5 en zijn afhankelijk van gewrichtsspecifieke mechanische laadmechanismen6. Deze patronen veranderen van paren en snaren in gezond kraakbeen tot dubbele snaren met het begin van artrose (OA). Met verdere progressie van de ziekte vormen de chondrocyten kleine clusters, die geleidelijk in omvang toenemen tot grote clusters in geavanceerde OA. Een volledig verlies van een organisatiestructuur en inductie van apoptose wordt waargenomen in eindfase OA. Zo kan chondrocyte cellulaire regeling worden gebruikt als een beeldgebaseerde biomarker voor OA progressie4.
Biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels regelen niet alleen hun vorm en functie, maar zijn ook cruciaal voor het behoud van hun vitaliteit. Veranderingen in elasticiteit kunnen zich voortplanten of leiden tot het begin van belangrijke ziekten zoals kanker of OA. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een krachtig instrument om de biomechanische eigenschappen van specifieke biologische doelstructuren op microscopische schaal, meten van een breed scala aan kracht, van piconewton tot de micronewton, kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren. De belangrijkste toepassing van de AFM is het meten van de oppervlaktetopografie en mechanische eigenschappen van monsters bij subnanometer resolutie7. Het meetapparaat bestaat uit drie hoofdcomponenten: 1) Een AFM-sonde, die een scherpe punt is die op een cantilever is gemonteerd en wordt gebruikt voor de directe interactie met het oppervlak van het monster. Wanneer kracht wordt toegepast op de cantilever, treedt vervorming van de laatste op volgens de eigenschappen van het gemeten weefsel. 2) Een optisch systeem dat een laserstraal projecteert op de cantilever, die vervolgens wordt gereflecteerd op een detectoreenheid. 3) Een fotodiode detector die het licht afbuigen van de cantilever vangt. Het zet de ontvangen informatie over de laser afbuiging door de cantilever in een kracht curve die kan worden geanalyseerd.
Het belangrijkste principe van de AFM is dus de detectie van de kracht tussen de AFM-sonde en de doelstructuur van het monster. De verkregen krachtkrommen beschrijven de mechanische eigenschappen van de doelstructuren op het monsteroppervlak, zoals elasticiteit, ladingsverdeling, magnetisatie, opbrengstspanning en elastische plastische vervormingsdynamiek8. Een belangrijk voordeel van de AFM ten opzichte van andere beeldvormingstechnieken is dat de AFM kan worden gebruikt om de mechanische eigenschappen van levende cellen in medium of weefsels in een inheemse staat te meten zonder het weefsel te beschadigen. AFM kan zowel in vloeibare als droge omstandigheden werken. Er is geen vereiste voor de voorbereiding van de monsters. DE AFM biedt de mogelijkheid om een monster in beeld te brengen en tegelijkertijd zijn mechanische eigenschappen te meten in monsters die in de buurt van fysiologische omstandigheden zijn. In deze studie beschrijven we een nieuwe benadering om OA-progressie te beoordelen door de elasticiteit van het PCM en de ECM in inheems gewrichtskraakbeen te meten. De correlatie van ruimtelijke organisatie van chondrocyten met de mate van lokale weefseldegeneratie biedt een compleet nieuw perspectief voor vroege detectie van OA. De functionele relevantie van deze patronen is echter nog niet geëvalueerd. Omdat de belangrijkste functie van gewrichtskraakbeen dragend is bij lage wrijving, moet het weefsel elastische eigenschappen hebben. AFM maakt het meten van niet alleen de elasticiteit van de ECM, maar ook van de ruimtelijke cellulaire patronen ingebed in hun PCM. De waargenomen correlatie van elasticiteit met ruimtelijke patroonverandering van de chondrocyten is zo sterk dat alleen al het meten van elasticiteit stratificatie van lokale weefseldegeneratie mogelijk kan zijn.
Elastische moduli van de PCM en ECM werden beoordeeld in 35 μm-dunne secties met behulp van een AFM-systeem geïntegreerd in een omgekeerde fase contrast microscoop die gelijktijdige visualisatie van het kraakbeen monster toegestaan. Dit protocol is gebaseerd op een studie die al is gepubliceerd vanuit ons laboratorium9 en beschrijft specifiek hoe de ruimtelijke ordening van de chondrocyten kan worden gekarakteriseerd en hoe de elasticiteit van hun bijbehorende PCM en ECM kan worden gemeten. Bij elke patroonverandering van de chondrocyten kunnen ook significante veranderingen in elasticiteit worden waargenomen voor zowel het PCM als de ECM, waardoor deze techniek kan worden gebruikt om het stadium van degeneratie van het kraakbeen direct te meten.
Deze gevalideerde aanpak opent een nieuwe manier om OA-progressie en therapeutische effecten in een vroeg stadium te evalueren voordat macroscopische weefselafbraak daadwerkelijk begint te verschijnen. Consequent AFM-metingen uitvoeren is een moeizaam proces. In het volgende protocol beschrijven we hoe het monster kan worden gemeten door de AFM, hoe de werkelijke AFM-metingen worden uitgevoerd te beginnen met de voorbereiding van de cantilever, hoe de AFM te kalibreren en vervolgens hoe de metingen uit te voeren. Stapsgewijze instructies geven een duidelijke en beknopte aanpak om betrouwbare gegevens te verkrijgen en basisstrategieën te bieden voor de verwerking en interpretatie ervan. De discussie sectie beschrijft ook de meest voorkomende valkuilen van deze rigoureuze methode en biedt nuttige tips voor het oplossen van problemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van AFM als een nieuwe en krachtige techniek om de biomechanische eigenschappen van biologische materialen op nanoschaalniveau te meten, maten we de elastische eigenschappen van de ECM en PCM in menselijk artrose articulair kraakbeen. Kraakbeenmonsters werden geselecteerd op basis van hun overheersende ruimtelijke patroon van de chondrocyteorganisatie als een op afbeeldingen gebaseerde biomarker voor lokale weefseldegeneratie. Zoals verwacht werd een sterke daling van de waarde van elasticiteit van zowel ECM a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken onze co-auteurs van de oorspronkelijke publicatie voor hun hulp en steun.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Riferimenti
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
