Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana
Summary
Presentamos un método para investigar los cambios osteoartríticos tempranos a nivel celular en el cartílago articular mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AFM).
Abstract
Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer u osteoartritis (OA). La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una herramienta fuerte para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo fuerzas en un rango tan pequeño como el piconewton hasta el micronewton. Las propiedades biomecánicas son de especial importancia en los tejidos musculoesqueléticos, que están sometidos a altos niveles de tensión. OA como una enfermedad degenerativa del cartílago resulta en la interrupción de la matriz pericelular (PCM) y la reorganización espacial de los condrocitos incrustados en su matriz extracelular (ECM). La interrupción en PCM y ECM se ha asociado con cambios en las propiedades biomecánicas del cartílago. En el presente estudio utilizamos AFM para cuantificar estos cambios en relación con los cambios específicos del patrón espacial de los condrocitos. Con cada cambio de patrón, se observaron cambios significativos en la elasticidad para el PCM y el ECM. La medición de la elasticidad local permite sacar conclusiones directas sobre el grado de degeneración del tejido local en OA.
Introduction
El cartílago articular es un tejido avascular y aneural. Los condrocitos escasamente dispersos producen, organizan y mantienen una matriz extracelular expansiva (ECM) en la que están incrustados. Como parte distinta y especializada del ECM, los condrocitos están rodeados por una fina capa de matriz especializada conocida como matriz pericelular (PCM). El PCM actúa como una interfaz de matriz celular sensible al mecanosensible 1 que protege los condrocitos2 y modula su respuesta biosintética3. Como se describió anteriormente4, en cartílago sano, los condrocitos están dispuestos en patrones espaciales específicos y distintos que son específicos para cada capa de tejido y articulación4,5 y dependen de los mecanismos de carga mecánica específicos de la articulación6. Estos patrones cambian de pares y cuerdas en cartílago sano a cuerdas dobles con la aparición de osteoartritis (OA). Con una mayor progresión de la enfermedad, los condrocitos forman pequeños racimos, aumentando gradualmente en tamaño a grandes racimos en OA avanzado. Una pérdida completa de cualquier estructura organizativa e inducción de la apoptosis se observa en la etapa final OA. Por lo tanto, la disposición celular de condrocitos se puede utilizar como un biomarcador basado en imágenes para la progresión de OA4.
Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer o la OA. La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una poderosa herramienta para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo una amplia gama de fuerza, desde piconewton hasta la micronewton. La principal aplicación de AFM es medir la topografía superficial y las propiedades mecánicas de las muestras a la resolución del subnómetro7. El dispositivo de medición consta de tres componentes principales: 1) Una sonda AFM, que es una punta afilada montada en un voladizo y se utiliza para la interacción directa con la superficie de la muestra. Cuando se aplica la fuerza al voladizo, la deformación de este último se produce de acuerdo con las propiedades del tejido medido. 2) Un sistema óptico que proyecta un rayo láser en el voladizo, que luego se refleja en una unidad detectora. 3) Un detector de fotodiodo que capta la luz desviada del voladizo. Convierte la información recibida sobre la desviación láser por el voladizo en una curva de fuerza que se puede analizar.
Por lo tanto, el principio principal de AFM es la detección de la fuerza que actúa entre la sonda AFM y la estructura objetivo de la muestra. Las curvas de fuerza obtenidas describen las propiedades mecánicas de las estructuras objetivo en la superficie de la muestra como elasticidad, distribución de carga, magnetización, tensión de rendimiento y dinámica de deformación plástica elástica8. Una ventaja importante de La AFM sobre otras técnicas de diagnóstico por imágenes es que el AFM se puede utilizar para medir las propiedades mecánicas de las células vivas en medios o tejidos en un estado nativo sin dañar el tejido. AFM puede funcionar tanto en condiciones líquidas como secas. No hay ningún requisito para la preparación de la muestra. AFM ofrece la posibilidad de tomar imágenes de una muestra y medir sus propiedades mecánicas simultáneamente en especímenes que están cerca de condiciones fisiológicas. En el presente estudio describimos un enfoque novedoso para evaluar la progresión de la OA midiendo la elasticidad del PCM y el ECM en el cartílago articular nativo. La correlación de la organización espacial de los condrocitos con el grado de degeneración del tejido local proporciona una perspectiva completamente nueva para la detección temprana de OA. Sin embargo, la relevancia funcional de estos patrones no se ha evaluado hasta ahora. Debido a que la función principal del cartílago articular es la carga que tiene una fricción baja, el tejido debe poseer propiedades elásticas. AFM permite medir no sólo la elasticidad del ECM, sino también de los patrones celulares espaciales incrustados en su PCM. La correlación observada de elasticidad con el cambio de patrón espacial de los condrocitos es tan fuerte que la medición de la elasticidad por sí sola puede permitir la estratificación de la degeneración del tejido local.
Los módulos elásticos del PCM y el ECM se evaluaron en secciones de 35 m de grosor utilizando un sistema AFM integrado en un microscopio de contraste de fase invertido que permitía la visualización simultánea de la muestra de cartílago. Este protocolo se basa en un estudio ya publicado en nuestro laboratorio9 y describe específicamente cómo caracterizar la disposición espacial de los condrocitos y cómo medir la elasticidad de su PCM y ECM asociados. Con cada cambio de patrón de los condrocitos, también se pueden observar cambios significativos en la elasticidad tanto para el PCM como para el ECM, permitiendo que esta técnica se utilice para medir directamente la etapa de degeneración del cartílago.
Este enfoque validado abre una nueva manera de evaluar la progresión de la OA y los efectos terapéuticos en las primeras etapas antes de que la degradación del tejido macroscópico realmente comience a aparecer. Realizar mediciones de AFM consistentemente es un proceso arduo. En el siguiente protocolo describimos cómo preparar la muestra a medir por AFM, cómo realizar las mediciones reales de AFM comenzando con la preparación del voladizo, cómo calibrar el AFM, y luego cómo realizar las mediciones. Las instrucciones paso a paso proporcionan un enfoque claro y conciso para obtener datos confiables y proporcionar estrategias básicas para procesarlos e interpretarlos. La sección de discusión también describe los escollos más comunes de este método riguroso y proporciona consejos útiles para la solución de problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando AFM como una técnica novedosa y poderosa para medir las propiedades biomecánicas de los materiales biológicos a un nivel nanoescala, medimos las propiedades elásticas del ECM y pcM en el cartílago articular osteoartrítico humano. Las muestras de cartílago se seleccionaron de acuerdo con su patrón espacial predominante de organización de condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración del tejido local. Como era de esperar, se observó una fuerte disminución en los valores de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros coautores de la publicación original por su ayuda y apoyo.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Riferimenti
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
