Anvendelse af Atomic Force Mikroskopi til at opdage tidlig slidgigt
Summary
Vi præsenterer en metode til at undersøge tidlige osteoarthritiske ændringer på celleniveau i ledbrusk ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM).
Abstract
Biomekaniske egenskaber af celler og væv ikke kun regulere deres form og funktion, men er også afgørende for at bevare deres vitalitet. Ændringer i elasticitet kan udbrede eller udløse udbrud af større sygdomme som kræft eller slidgigt (OA). Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et stærkt redskab til kvalitativt og kvantitativt at karakterisere de biomekaniske egenskaber af specifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, måle kræfter i en række fra så lille som piconewton til mikronewton. Biomekaniske egenskaber er af særlig betydning i muskel- og skeletvæv, som udsættes for høje belastningsniveauer. OA som en degenerativ sygdom i brusk resulterer i afbrydelse af den pericellulære matrix (PCM) og den rumlige omlægning af chondrocytter indlejret i deres ekstracellulære matrix (ECM). Disruption i PCM og ECM har været forbundet med ændringer i bruskens biomekaniske egenskaber. I denne undersøgelse brugte vi AFM til at kvantificere disse ændringer i forhold til de specifikke ændringer i rumlige mønstre af chondrocytterne. Ved hver mønsterændring blev der observeret betydelige ændringer i elasticiteten for både PCM og ECM. Måling af den lokale elasticitet giver således mulighed for at drage direkte konklusioner om graden af lokal vævsdegeneration i OA.
Introduction
Ledbrusk er en avaskulær, aneuralvæv. Sparsomt spredte chondrocytter producere, organisere og vedligeholde en ekspansiv ekstracellulær matrix (ECM), hvor de er indlejret. Som en særskilt og specialiseret del af ECM, chondrocytter er omgivet af et tyndt lag af specialiserede matrix kendt som pericellulære matrix (PCM). PCM fungerer som en mechanosensitive celle-matrix interface1, der beskytter chondrocytes2 og modulerer deres biosyntetiske respons3. Som tidligere beskrevet4, i sund brusk, chondrocytter er arrangeret i specifikke, forskellige rumlige mønstre, der er specifikke for hvert væv lag og fælles4,5 og afhænger af fælles-specifikke mekaniske lastning mekanismer6. Disse mønstre skifter fra par og strenge i sund brusk til dobbelte strenge med debut af slidgigt (OA). Med yderligere progression af sygdommen danner chondrocytter små klynger, stigende gradvist i størrelse til store klynger i avanceret OA. Et fuldstændigt tab af enhver organisatorisk struktur og induktion af apoptose er observeret i slutstadiet OA. Således, chondrocyt cellulære arrangement kan bruges som et billede-baseret biomarkør for OA progression4.
Biomekaniske egenskaber af celler og væv ikke kun regulere deres form og funktion, men er også afgørende for at bevare deres vitalitet. Ændringer i elasticitet kan udbrede eller udløse udbrud af større sygdomme som kræft eller OA. Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et kraftfuldt redskab til kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskaber af specifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, der måler en bred vifte af kraft, fra piconewton til mikronewton. Den vigtigste anvendelse af AFM er at måle overfladetopografien og de mekaniske egenskaber af prøver ved opløsning 7 af subnanometer. Måleanordningen består af tre hovedkomponenter: 1) En AFM-sonde, som er en skarp spids monteret på en cantilever og anvendes til direkte interaktion med prøvens overflade. Når der påføres kraft på kantiler, deformation af sidstnævnte sker i henhold til den målte vævs egenskaber. 2) Et optisk system, der projicerer en laserstråle på cantilever, som derefter afspejles til en detektorenhed. 3) En fotodiodedetektor, der fanger lyset afbøjet fra cantilever. Det konverterer de modtagne oplysninger om laser afbøjning af cantilever i en kraft kurve, der kan analyseres.
Hovedprincippet i AFM er således påvisning af den kraft, der virker mellem AFM-sonden og prøvens målstruktur. De opnåede kraftkurver beskriver målstrukturernes mekaniske egenskaber på prøveoverfladen som elasticitet, ladningsfordeling, magnetisering, udbyttestress og elastisk plastdeformationsdynamik8. En vigtig fordel ved AFM i forhold til andre billeddannelse teknikker er, at AFM kan bruges til at måle de mekaniske egenskaber af levende celler i medium eller væv i en indfødt tilstand uden at beskadige vævet. AFM kan fungere både under flydende eller tørre forhold. Der er ikke noget krav om forberedelse af prøver. AFM giver mulighed for at afbilde en prøve og måle dens mekaniske egenskaber samtidigt i prøver, der er tæt på fysiologiske forhold. I denne undersøgelse beskriver vi en ny tilgang til at vurdere OA progression ved at måle elasticiteten af PCM og ECM i indfødte ledbrusk. Korrelationen mellem rumlig organisering af chondrocytter med graden af lokal vævsdegeneration giver et helt nyt perspektiv for tidlig påvisning af OA. Den funktionelle relevans af disse mønstre er imidlertid endnu ikke blevet evalueret. Fordi den vigtigste funktion af ledbrusk er bærende ved lav friktion, skal vævet have elastiske egenskaber. AFM gør det muligt at måle ikke blot ecm’ens elasticitet, men også de rumlige cellemønstre, der er indlejret i deres PCM. Den observerede korrelation mellem elasticitet og rumlig mønsterændring af chondrocytterne er så stærk, at måling af elasticitet alene kan tillade stratificering af lokal vævsdegeneration.
Elastisk moduli af PCM og ECM blev vurderet i 35 μm tynde sektioner ved hjælp af et AFM-system integreret i et omvendt fasekontrastmikroskop, der tillod samtidig visualisering af bruskprøven. Denne protokol er baseret på en undersøgelse, der allerede er offentliggjort fra vores laboratorium9 og specifikt beskriver, hvordan man karakteriserer den rumlige arrangement af chondrocytter og hvordan man kan måle elasticiteten i deres tilknyttede PCM og ECM. Ved hver mønsterændring af chondrocytterne kan der også observeres betydelige ændringer i elasticiteten for både PCM og ECM, hvilket gør det muligt at bruge denne teknik til direkte at måle bruskstadens degeneration.
Denne validerede tilgang åbner en ny måde at evaluere OA progression og terapeutiske virkninger på tidlige stadier, før makroskopisk væv nedbrydning faktisk begynder at dukke op. Udførelse af AFM målinger konsekvent er en vanskelig proces. I den følgende protokol beskriver vi, hvordan du forbereder prøven, der skal måles ved AFM, hvordan man udfører de faktiske AFM målinger startende med forberedelse af cantilever, hvordan man kalibrerer AFM, og derefter hvordan man udfører målingerne. Trinvise instruktioner giver en klar og præcis tilgang til at opnå pålidelige data og tilvejebringe grundlæggende strategier for behandling og fortolkning af dem. Diskussionsafsnittet beskriver også de mest almindelige faldgruber ved denne strenge metode og indeholder nyttige fejlfindingstip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af AFM som en ny og kraftfuld teknik til at måle biologiske materialers biomekaniske egenskaber på nanoskalaniveau målte vi ECM’ens og PCM’s elastiske egenskaber i den menneskelige osteoarthritiske ledbrusk. Bruskprøver blev udvalgt i henhold til deres fremherskende rumlige mønster af chondrocyt organisation som en billedbaseret biomarkør for lokal vævdegeneration. Som forventet blev der observeret et kraftigt fald i værdierne for elasticitet i både ECM og PCM langs den rumlige reorganisering af chond…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker vores medforfattere fra den oprindelige publikation for deres hjælp og støtte.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Riferimenti
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
