En platform for hydrogendeuteriumudvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) til undersøgelse af peptidbiosyntetiske enzymer

Summary

Lanthipeptide synthetases katalyserer multistep reaktioner under biosyntesen af peptid naturlige produkter. Her beskriver vi en kontinuerlig, bottom-up, hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDX-MS) workflow, der kan anvendes til at studere kropsbygning dynamik lanthipeptid synthetaser, samt andre lignende enzymer involveret i peptid naturlige produkt biosyntese.

Abstract

Hydrogen-deuterium exchange mass spektrometri (HDX-MS) er en kraftfuld metode til biofysisk karakterisering af enzymkonformationelle ændringer og enzym-substratinteraktioner. Blandt de mange fordele bruger HDX-MS kun små mængder materiale, kan udføres under næsten indfødte forhold uden behov for enzym/ substratmærkning og kan give rumligt løst information om enzymkonformationsdynamik – selv for store enzymer og multiproteinkomplekser. Metoden indledes ved fortynding af etzymet af interesse i buffer tilberedt i D₂O. Dette udløser udveksling af protium i peptidbinding midt (N-H) med deuterium (N-D). På de ønskede udvekslingstidspunkter slukkes reaktions-aliquots, enzymet proteolyzed i peptider, peptider adskilles af ultra-performance væskekromatografi (UPLC), og ændringen i massen af hver peptid (på grund af udveksling af brint til deuterium) registreres af MS. Mængden af deuterium optagelse af hver peptid er stærkt afhængig af den lokale brint limning miljø af denne peptid. Peptider, der er til stede i meget dynamiske områder af enzymet, udveksler deuterium meget hurtigt, mens peptider fra velordnede regioner udveksles meget langsommere. På denne måde rapporterer HDX-hastigheden om lokal enzymformationsdynamik. Perturbationer til deuteriumoptagelsesniveauer i nærværelse af forskellige ligands kan derefter bruges til at kortlægge ligandbindingssteder, identificere allosteriske netværk og til at forstå konformationsdynamikkens rolle i enzymfunktion. Her illustrerer vi, hvordan vi har brugt HDX-MS til bedre at forstå biosyntesen af en type peptid naturlige produkter kaldet lanthipeptider. Lanthipeptider er genetisk kodede peptider, der er postoversættelsesmæssigt modificeret af store, multifunktionelle, kropsbygningsdynamiske enzymer, der er vanskelige at studere med traditionelle strukturelle biologi tilgange. HDX-MS er en ideel og fleksibel platform til undersøgelse af disse typer enzymers mekanistiske egenskaber.

Introduction

Proteiner er strukturelt dynamiske molekyler, der prøver forskellige konformationer på tidsskalaer, der spænder fra femtosekundsbindingsvibrationer til omlægninger af hele proteindomæner, som kan forekomme over mange sekunder¹. Disse konformationelle udsving er ofte kritiske aspekter af enzym/ proteinfunktion. For eksempel er kropsbygningsændringer forårsaget af ligandbinding ofte af afgørende betydning for modulerende enzymfunktion, enten ved at organisere aktive stedrester, der er nødvendige for katalyse, definere substratbindingssteder i sekventielle kinetiske mekanismer, beskytte reaktive mellemprodukter fra miljøet eller ved at modulere enzymfunktion via allosteriske netværk. Nylige undersøgelser har også vist , at kropsbygningsdynamik kan bevares gennem hele evolutionen , og at turbationer til bevarede molekylære bevægelser kan korreleres med ændringer i substratspecifikitet og fremkomsten af nye enzymfunktioner^2,3.

I de senere år har hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDX-MS) hurtigt vist sig som en kraftfuld teknik til at sonde, hvordan protein konformationelle landskaber reagerer på perturbationer såsom ligand binding eller mutagenesis^4,5,6,7. I et typisk HDX-MS-eksperiment (Figur 1) anbringes et protein af interesse i buffer tilberedt i D₂O, hvilket udløser udskiftning af opløsningsmiddelbyttelige protoner med deuteria. Valutakursen for peptidbindingernes midte er stærkt afhængig af pH, den lokale aminosyresekvens og af amideens lokale strukturelle miljø⁸. Amider, der beskæftiger sig med hydrogenbindingsinteraktioner (som dem, der er til stede i α-helices og β-sheets), udveksler langsommere end midt i ustrukturerede områder af proteinet, der udsættes for bulkopløsningsmiddel. Således er omfanget af deuteriumoptagelse en afspejling af enzymets struktur. Enzymer, der er kropsbygningsdynamiske, eller som gennemgår strukturelle overgange ved ligandbinding, forventes at give et målbart HDX-respons.

Det mekanistiske grundlag for den langsomme valutakurs for en struktureret midte fremgår af figur 2^5,8,9. For at kunne gennemgå HDX skal den strukturerede region først forbigående prøve en udfoldet kropsbygning, således at de opløsningsmiddelmolekyler, der katalyserer HDX-udveksling via en bestemt syre/base kemisk mekanisme, har adgang til det udskiftelige midt. I sidste ende bestemmer de relative størrelser af den kemiske valutakurs (k_chem) og folde- og refoldingskurserne (k_åben og k_tæt) HDX-kursen målt i eksperimentet^5,8. Fra denne enkle kinetiske model er det klart, at omfanget af deuteriumoptagelse vil afspejle den underliggende kropsbygningsdynamik (som defineret af k_open og k_close). De fleste HDX-MS-eksperimenter udføres i en bottom-up-arbejdsgang, hvor interesseproteinet efter udvekslingsreaktionen fordøjes til peptider, og deuteriumoptagelsen af hver peptid måles som en stigning i masse⁷. På denne måde tillader HDX-MS, at der kortlægges forstyrrelser af enzymens kropsbygningsdynamik på den lokale rumlige skala af peptider, hvilket gør det muligt for forskeren at vurdere, hvordan forstyrrelsen ændrer dynamikken i forskellige områder af interesseens enzym.

Fordelene ved HDX-MS-tilgangen til belysning af proteinstrukturel dynamik er talrige. For det første kan metoden udføres med små mængder indfødt protein eller på proteinkomplekser i systemer med kvartær struktur¹⁰. Det er ikke engang nødvendigt, at det enzympræparat, der anvendes i^analysen,skal være stærkt renset¹¹,¹², så længe bottom-up HDX-MS-arbejdsgangen giver et tilstrækkeligt antal selvsikkert identificerede peptider, der dækker proteinsekvensen af interesse. Desuden kan HDX-MS give oplysninger om kropsbygningsdynamik under næsten indfødte forhold uden behov for stedsspecifik proteinmærkning, som ville blive anvendt i enkeltmolekyle fluorescensundersøgelser¹³, og der er ingen størrelsesgrænse for protein- eller proteinkomplekset, der kan undersøges (hvilket gør tilgange som nuklear magnetisk resonans [NMR] spektroskopi udfordrende)^7,14. Endelig kan tidsløste HDX-MS-metoder anvendes til at studere iboende uordnede proteiner, som er vanskelige at studere med røntgenkrystallografi^15,16,17,18. Den vigtigste begrænsning af HDX-MS er, at dataene har lav strukturel opløsning. HDX-MS-data er nyttige til at pege på, hvor kropsbygningsdynamikken ændrer sig, og til at afsløre koblede kropsbygningsændringer, men de giver ikke ofte meget indsigt i den præcise molekylære mekanisme, der driver den observerede ændring. De seneste fremskridt inden for kombinationen af metoder til afkobling af elektronfangst med data fra protein-HDX-MS har vist lovende resultater med hensyn til kortlægning af udvekslingssteder for enkelt aminosyrerester¹⁹, men der er stadig ofte behov for opfølgende biokemiske og strukturelle undersøgelser for at skabe klarhed om strukturelle modeller, der fremsendes af DATA FRA HDX-MS.

Nedenfor præsenteres en detaljeret protokol for udvikling af en HDX-MS-analyse²⁰. Nedenstående prøveforberedelsesprotokoller bør generelt gælde for ethvert protein, der udviser god opløselighed i vandige buffere. Der findes mere specialiserede prøveforberedelsesmetoder og HDX-MS-arbejdsgange for proteiner, end det er nødvendigt at analysere i nærværelse af vaskemiddel eller fosfolipider^21,22,23,24. Instrumentale indstillinger for INDSAMLING AF HDX-MS-data beskrives for et firdobbelt flyvetidsspektrometer med høj opløsning koblet til flydende kromatografisystem. Der kan indsamles data af samme kompleksitet og opløsning på et hvilket som helst af en række kommercielt tilgængelige systemer til flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Der findes også nøgleaspekter af databehandlingen ved hjælp af en softwarepakke, der er kommercielt tilgængelig. Vi præsenterer også retningslinjer for dataindsamling og -analyse, der er i overensstemmelse med anbefalingerne fra det bredere HDX-MS community¹². Den beskrevne protokol bruges til at studere halM2’s dynamiske strukturelle egenskaber, en lanthipeptidsynetase, der katalyserer multistepmodningen af et antimikrobielt peptid naturligt produkt²⁰. Vi illustrerer, hvordan HDX-MS kan bruges til at afsløre substratbindingssteder og allosteriske egenskaber, der har undgået tidligere karakterisering. Flere andre protokoller om protein HDX-MS er blevet offentliggjort i de seneste år^25,26. Sammen med det nuværende arbejde skulle disse tidligere bidrag give læseren en vis fleksibilitet i eksperimentelt design.

Protocol

1. Fremstilling af deutererede reagenser og enzymstrømpeopløsninger Forbered reagenser, der er nødvendige for HDX-reaktionerne (herunder eventuelle buffere, salte, substrater, ligands osv.) som 100−200x koncentrerede stamopløsninger i D2O (99,9% atomfraktion D). Forbered mindst 50 ml bufferlageropløsning.BEMÆRK: Til karakterisering af HalM2, Der blev fremstillet følgende opløsninger: 500 mM MgCl2,100 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), 750 mM ATP (i HEPES-buffer), 800 mM…

Representative Results

Det er nødvendigt at vurdere kvaliteten af den proteolytiske fordøjelse og reproducerbarheden af arbejdsgangen for hvert sæt prøveinjektioner. Før der udføres HDX-MS-assays, er det således vigtigt at etablere effektive betingelser for proteolyse af det protein, der er af interesse, for adskillelse af peptider ved hjælp af omvendt fase flydende kromatografi og gasfaseionmobilitet og til påvisning af peptider ved hjælp af MS. Med henblik herpå bør referenceprøverne for det pågældende protein (indsamlet uden …

Discussion

HDX-MS-arbejdsgangen, der præsenteres i denne protokol, giver en bemærkelsesværdig robust platform til kortlægning af den rumlige fordeling af strukturelt dynamiske elementer i proteiner og til at undersøge, hvordan disse dynamikker ændrer sig som reaktion på forstyrrelse (ligandbinding, enzym mutagenese osv.). HDX-MS har flere forskellige fordele i forhold til andre strukturelle biologi tilgange, der er almindeligt anvendt til at undersøge kropsbygning dynamik. Mest bemærkelsesværdigt er der kun behov for små…

Materials

Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)	BioBasic	NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)	Milipore Sigma	UFC501096
acetonitrile	Fisher	A955-1
AMP-PNP	SIGMA	A2647-25MG
ATP	SIGMA	a2383-5G
D2O	ALDRICH	435767-100G
formic acid	Thermo Fisher	28905
guanidine-HCl	VWR	97063-764
HEPES	Fisher	BP310-1
Magnesium chloride	SiGMA-Aldrich	63068-250G
Potassium chloride	BioBasic	PB0440
potassium phosphate	BioBasic	PB0445
TCEP Hydrochloride	TRC Canada	T012500	peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
software
Deuteros	Andy M C Lau, et al	version 1.08
DynamX	Waters	version 3.0
MassLynx	Waters	version 4.1
Protein Lynx Global Server (PLGS)	Waters	version 3.0.3
PyMOL	Schrödinger	version 2.2.2
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column	Waters	186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column	Waters	186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System	Waters
HDX Manager	Waters
microtip pH electrode	Thermo Fisher	13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn	Waters	186007233
Waters Synapt G2-Si	Waters