Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus
Summary
Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.
Abstract
De gepresenteerde procedures beschrijven een gegeneraliseerde methodologie om Aedes aegypti-muggen te infecteren met het Zika-virus onder laboratoriumomstandigheden om de infectiesnelheid, gedissemineerde infectie en mogelijke overdracht van het virus in de betreffende muggenpopulatie te bepalen. Deze procedures worden op grote schaal gebruikt met verschillende wijzigingen in vectorcompetentie-evaluaties wereldwijd. Ze zijn belangrijk bij het bepalen van de potentiële rol die een bepaalde mug (d.w.z. soort, populatie, individu) kan spelen bij de overdracht van een bepaald middel.
Introduction
Vectorcompetentie wordt gedefinieerd als het vermogen op het niveau van soort, populatie en zelfs een individu van een bepaalde geleedpotige zoals een mug, teek of flebotomine zandvlieg, om een agens biologisch te verwerven en over te dragen met replicatie of ontwikkeling in de geleedpotige1,2. Met betrekking tot muggen en door geleedpotigen overgedragen virussen (d.w.z. arbovirussen), wordt het middel door een vrouwelijke mug uit een viremische gastheer geïmpregneerd. Na inname moet het virus productief een van een kleine populatie midgut-epitheelcellen infecteren3, waarbij verschillende fysiologische obstakels worden overwonnen, zoals proteolytische afbraak door spijsverteringsenzymen, de aanwezigheid van de microbiota (midgut-infectiebarrière of MIB) en de uitgescheiden peritrofische matrix. Infectie van het midgut-epitheel moet worden gevolgd door replicatie van het virus en uiteindelijk ontsnapping uit het midgut in de open bloedsomloop van de mug, of hemolymfe, wat het begin vertegenwoordigt van een gedissemineerde infectie die de midgut-ontsnappingsbarrière (MEB) overwint. Op dit punt kan het virus infecties van secundaire weefsels (bijv. Zenuwen, spieren en vetlichamen) vaststellen en zich blijven vermenigvuldigen, hoewel een dergelijke secundaire replicatie mogelijk niet strikt noodzakelijk is voor het virus om de acinaire cellen van de speekselklieren te infecteren (het overwinnen van de speekselklierinfectiebarrière). Uitgaan van de speekselklier acinar cellen in hun apicale holtes en vervolgens beweging in het speekselkanaal maakt inenting van het virus in volgende gastheren bij bijten mogelijk en voltooit de transmissiecyclus1,2,4,5,6,7.
Gezien dit goed gekarakteriseerde en over het algemeen geconserveerde mechanisme van verspreiding binnen een muggenvector, zijn laboratoriumvectorcompetentiebeoordelingen vaak methodologisch vergelijkbaar, hoewel er verschillen in protocollen bestaan1,2. Over het algemeen worden muggen na orale blootstelling aan het virus ontleed, zodat individuele weefsels zoals het midgut, benen, eierstokken of speekselklieren kunnen worden getest op virale infectie, gedissemineerde infectie, gedissemineerde infectie / potentiële transovariale overdracht en gedissemineerde infectie / potentiële overdrachtscompetentie, respectievelijk8. De loutere aanwezigheid van een virus in de speekselklieren is echter geen definitief bewijs van overdrachtsvermogen, gezien het bewijs van een speekselklier ontsnapping / uitgang barrière (SGEB) in sommige vector / virus combinaties1,2,4,5,7,9. De standaardmethode om overdrachtscompetentie aan te tonen blijft muggenoverdracht op een vatbaar dier10,11,12. Aangezien dit voor veel arbovirussen echter het gebruik van immuungecompromitteerde muizenmodellen13,14,15,16vereist, is deze methode vaak onbetaalbaar. Een veelgebruikt alternatief is het verzamelen van het muggenspeeksel, dat kan worden geanalyseerd door reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) of een infectieuze test om de aanwezigheid van respectievelijk het virale genoom of infectieuze deeltjes aan te tonen. Het is vermeldenswaard dat dergelijke in vitro speekselverzamelingsmethoden12 kunnen overschatten of17 de hoeveelheid virus die tijdens in vivo voeding wordt afgezet, kunnen onderschatten, wat aangeeft dat dergelijke gegevens met de nodige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd. Niettemin is de in vitro-methode zeer waardevol wanneer geanalyseerd vanuit het perspectief van de loutere aanwezigheid van virus in het speeksel, wat wijst op transmissiepotentieel.
Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor het bepalen van de rol van muggenvectoren bij uitbraken van arbovirale ziekten. De eerste methode omvat veldbewaking, waarbij muggen worden verzameld in het kader van actieve overdracht18,19,20,21,22,23,24. Aangezien de infectiepercentages echter doorgaans vrij laag zijn (bijv. de geschatte 0,061% infectiegraad van muggen in gebieden met actieve Zika-virus (ZIKV) circulatie in de Verenigde Staten21), kan de beschuldiging van potentiële vectorsoorten sterk worden beïnvloed door vangmethode25,26 en willekeurige kans (bijv. Bemonstering van één geïnfecteerd individu op 1.600 niet-geïnfecteerden)21 . Hiermee rekening houdend, kan een bepaald onderzoek mogelijk niet voldoende muggen verwerven in zowel ruwe aantallen als soortendiversiteit om muggen die betrokken zijn bij overdracht nauwkeurig te bemonsteren. Vectorcompetentieanalyses worden daarentegen uitgevoerd in een laboratoriumomgeving, waardoor strikte controle van parameters zoals orale dosis mogelijk is. Hoewel ze niet volledig in staat zijn om de ware complexiteit van muggeninfectie en overdrachtscapaciteit in een veldomgeving weer te geven, blijven deze laboratoriumbeoordelingen krachtige hulpmiddelen op het gebied van arbovirologie.
Op basis van verschillende vectorcompetentieanalyses met ZIKV in verschillende muggensoorten, populaties en methoden27,28,29,30,31,32,evenals een recent overzicht van vectorcompetentiebeoordelingen1,beschrijven we hier verschillende protocollen die verband houden met een typische vectorcompetentieworkflow. In deze experimenten werden drie Ae. aegypti-populaties uit Amerika (de stad Salvador, Brazilië; de Dominicaanse Republiek; en de lagere Rio Grande-vallei, TX, VS) blootgesteld aan een enkele stam van ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bij 4, 5 of 6 log10 focusvormende eenheden (FFU) / ml-doses door middel van kunstmatige bloedmeel. Vervolgens werden ze geanalyseerd op bewijs van infectie, gedissemineerde infectie en transmissiecompetentie na verschillende tijden van extrinsieke incubatie (2, 4, 7, 10 en 14 dagen) door middel van dissectie en een op celcultuur gebaseerde infectieuze test. Hoewel de huidige workflow/protocollen zijn geoptimaliseerd voor ZIKV, zijn veel elementen direct vertaalbaar naar andere door muggen overgedragen arbovirussen in geleedpotige insluiting en bioveiligheidsniveaus 2 en 3 (ACL/BSL2 of ACL/BSL3).
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methoden bieden een gegeneraliseerde workflow om vectorcompetentieanalyses uit te voeren. Als algemeen kader worden veel van deze methodologieën in de literatuur bewaard. Er is echter aanzienlijke ruimte voor wijzigingen (besproken in Azar en Weaver1). Van virussen (bijv. virale afstamming, opslag van challenge-virus, virale passagegeschiedenis), entomologie (bijv. laboratoriumkolonisatie van muggenpopulaties, aangeboren immuniteit, het muggenmicrobioom / viroom) en experimente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen het personeel van het World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton en Divya Mirchandani, voor hun onvermoeibare werk bij het samenstellen en leveren van veel van de virale stammen die worden gebruikt voor de vectorcompetentie-experimenten van ons en andere groepen. Het gepresenteerde werk werd gefinancierd door het McLaughlin Fellowship Fund (SRA) en NIH-subsidies AI120942 en AI121452.
Materials
| 3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| 7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
| Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
| Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
| Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
| Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
| Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
| Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
| Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
| Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
| Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
| Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
| Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
| Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
| TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
Riferimenti
- Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
- Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
- Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
- Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
- Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
- Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
- Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).
- Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
- Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
- Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
- Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
- Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
- Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
- Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
- Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
- Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
- Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
- Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
- Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
- Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
- Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
- Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
- Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
- Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
- Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
- Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
- Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
- Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
- Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
- Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
- Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
- Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
- Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
- Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
- Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
- Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).
