Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika
Summary
El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.
Abstract
Los procedimientos presentados describen una metodología generalizada para infectar a los mosquitos Aedes aegypti con el virus del Zika en condiciones de laboratorio para determinar la tasa de infección, la infección diseminada y la posible transmisión del virus en la población de mosquitos en cuestión. Estos procedimientos se utilizan ampliamente con diversas modificaciones en las evaluaciones de competencias vectoriales a nivel mundial. Son importantes para determinar el papel potencial que un mosquito dado (es decir, especie, población, individuo) puede desempeñar en la transmisión de un agente determinado.
Introduction
La competencia vectorial se define como la capacidad a nivel de especie, población, e incluso un individuo, de un artrópodo dado, como un mosquito, garrapata o flebotomina, para adquirir y transmitir un agente biológicamente con replicación o desarrollo en el artrópodo1,2. Con respecto a los mosquitos y los virus transmitidos por artrópodos (es decir, arbovirus), el agente es absorbido de un huésped virémico por un mosquito hembra. Después de la ingestión, el virus debe infectar productivamente a una de una pequeña población de células epiteliales del intestino medio3,superando diversos obstáculos fisiológicos como la degradación proteolítica por enzimas digestivas, la presencia de la microbiota (barrera de infección del intestino medio, o MIB) y la matriz peritrófica secretada. La infección del epitelio del intestino medio debe ser seguida por la replicación del virus y el eventual escape del intestino medio al sistema circulatorio abierto del mosquito, o hemolinfa, que representa el inicio de una infección diseminada que supera la barrera de escape del intestino medio (MEB). En este punto, el virus puede establecer infecciones de tejidos secundarios (por ejemplo, nervios, músculos y cuerpos grasos) y continuar replicándose, aunque dicha replicación secundaria puede no ser estrictamente necesaria para que el virus infecte las células acinares de las glándulas salivales (superando la barrera de infección de las glándulas salivales). La salida de las células acinares de la glándula salival en sus cavidades apicales y luego el movimiento hacia el conducto salival permite la inoculación del virus en huéspedes posteriores al morder, y completa el ciclo de transmisión1,2,4,5,6,7.
Dado este mecanismo de propagación bien caracterizado y generalmente conservado dentro de un mosquito vector, las evaluaciones de competencia de vector de laboratorio son a menudo metodológicamente similares, aunque existen diferencias en los protocolos1,2. En general, después de la exposición oral al virus, los mosquitos se diseccionan para que los tejidos individuales como el intestino medio, las piernas, los ovarios o las glándulas salivales puedan ser evaluados para detectar infección viral, infección diseminada, infección diseminada / transmisión transovarial potencial e infección diseminada / competencia de transmisión potencial, respectivamente8. La mera presencia de un virus en las glándulas salivales, sin embargo, no es evidencia definitiva de capacidad de transmisión, dada la evidencia de una barrera de escape/salida de glándulas salivales (SGEB) en algunas combinaciones vector/virus1,2,4,5,7,9. El método estándar para demostrar la competencia de transmisión sigue siendo la transmisión de mosquitos a un animal susceptible10,11,12. Sin embargo, dado que para muchos arbovirus esto requiere el uso de modelos murinos inmunocomprometidos13,14,15,16, este método es a menudo prohibitivo. Una alternativa de uso común es la recolección de la saliva del mosquito, que puede analizarse mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) o un ensayo infeccioso para demostrar la presencia del genoma viral o partículas infecciosas, respectivamente. Vale la pena señalar que tales métodos de recolección de saliva in vitro pueden sobreestimar12 o subestimar17 la cantidad de virus depositado durante la alimentación in vivo, lo que indica que dichos datos deben interpretarse con precaución. Sin embargo, el método in vitro es muy valioso cuando se analiza desde la perspectiva de la mera presencia de virus en la saliva, lo que indica un potencial de transmisión.
Existen dos enfoques principales para determinar el papel de los mosquitos vectores en los brotes de enfermedades arbovirales. El primer método implica la vigilancia de campo, en la que los mosquitos se recogen en el contexto de la transmisión activa18,19,20,21,22,23,24. Sin embargo, dado que las tasas de infección suelen ser bastante bajas (por ejemplo, la tasa de infección estimada del 0,061% de mosquitos en áreas de circulación activa del virus del Zika (ZIKV) en los Estados Unidos21), la incriminación de posibles especies de vectores puede estar muy sesgada por la metodología de captura25,26 y el azar aleatorio (por ejemplo, tomar muestras de un individuo infectado de 1,600 no infectados)21 . Teniendo esto en cuenta, un estudio dado puede no adquirir suficientes mosquitos tanto en números brutos como en diversidad de especies para muestrear con precisión los mosquitos involucrados en la transmisión. Por el contrario, los análisis de competencia vectorial se llevan a cabo en un entorno de laboratorio, lo que permite un control estricto de parámetros como la dosis oral. Aunque no son totalmente capaces de representar la verdadera complejidad de la infección por mosquitos y la capacidad de transmisión en un entorno de campo, estas evaluaciones de laboratorio siguen siendo herramientas poderosas en el campo de la arbovirología.
Basándonos en varios análisis de competencia vectorial con ZIKV en varias especies de mosquitos, poblaciones y métodos27,28,29,30, 31,32,así como una revisión reciente de las evaluaciones de competencia vectorial1,describimos aquí varios de los protocolos asociados con un flujo de trabajo típico de competencia vectorial. En estos experimentos, tres poblaciones de Ae. aegypti de las Américas (la ciudad de Salvador, Brasil; la República Dominicana; y el valle inferior del Río Grande, TX, EE. UU.) fueron expuestas a una sola cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a dosis de 4, 5 o 6 log10 unidades formadoras de enfoque (FFU) / ml por medio de harinas de sangre artificiales. Posteriormente, se analizaron en busca de evidencia de infección, infección diseminada y competencia de transmisión después de varios tiempos de incubación extrínseca (2, 4, 7, 10 y 14 días) mediante disección y un ensayo infeccioso basado en cultivo celular. Aunque el flujo de trabajo / protocolos actuales están optimizados para ZIKV, muchos elementos son directamente traducibles a otros arbovirus transmitidos por mosquitos en los niveles de contención y bioseguridad de artrópodos 2 y 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí proporcionan un flujo de trabajo generalizado para realizar análisis de competencia vectorial. Como marco general, muchas de estas metodologías se conservan a lo largo de la literatura. Sin embargo, hay un espacio sustancial para las modificaciones (revisado en Azar y Weaver1). Se sabe que el virus (por ejemplo, el linaje viral, el almacenamiento del virus de desafío, la historia del paso viral), la entomología (por ejemplo, la colonización de laboratorio de las p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos al personal del Centro de Referencia Mundial para Virus Emergentes y Arbovirus (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzmán, Dr. Kenneth Plante, Dra. Jessica Plante, Dionna Scharton y Divya Mirchandani, por su incansable trabajo en la curaduría y provisión de muchas de las cepas virales utilizadas para nuestros experimentos de competencia vectorial y de otros grupos. El trabajo presentado fue financiado por el McLaughlin Fellowship Fund (SRA) y las subvenciones de los NIH AI120942 y AI121452.
Materials
| 3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| 7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
| Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
| Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
| Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
| Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
| Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
| Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
| Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
| Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
| Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
| Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
| Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
| Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
| TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
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